pCold-SUMO-10His原核蛋白表达试剂盒

库存 ：55

保质期 ： 2 年

供应商 ：上海西格

保存条件 ：-20°C

规格 ：1 kit

描述：本试剂盒所包含的原核表达载体(pCold-SUMO-10His)是在 pCold-SUMO 载体基础上改造而成( 专利)，

该载体启动子(CS Promoter)来源于南极嗜冷细菌，在低温下(15 度)才能启动蛋白的表达。低温下细菌生长缓慢，使得蛋白合成速度减慢，从而最大限度的提高了蛋白正确折叠的几率，提高了蛋白可溶性表达，增强了活性蛋白的表达比率。该表达系统所包含的 SUMO tag 可以极大地提高小分子量蛋白的表达量，而且进一步提高了蛋白的可溶表达几率。同时，TEE 信号肽可增强冷启动子调控下目的蛋白的高表达。
改进后的 pCold-SUMO-10His 载体，其 SUMO 蛋白标签含有 10 个组氨酸标签（10His tag），使其结合 Ni-NTA 的能力更强。与较早版本的 pCold-SUMO 表达系统相比，pCold-SUMO-10His 表达系统在保留了原有统的蛋白可溶性能生产能力、高特异性剪切能力的情况下，对 Ni-NTA 结合能力的得到明显提高。其对 Ni-NTA 结合能力的提高，

在以下三个方面改善了生产重组蛋白的性能：

（1）提高了粗蛋白样品中目标蛋白的捕获能力，从而提高纯化产量；

（2）在蛋白纯化过程中可以
使用更高浓度的咪唑进行漂洗，去杂蛋白的能力明显提升，从而获得更高纯度的重组蛋白；

（3）在重组蛋白酶切去除 SUMO标签后，利用 Ni-NTA 去除 SUMO 标签更为彻底，获得纯度更高的无标签目标蛋白。
关于宿主菌的使用：本试剂盒配备了两种宿主表达菌感受态细胞，Lyophilized Arctic (DE3)感受态和 LyophilizedBL21(DE3) Chaprone 感受态，两种感受态均为冻干品形式可长期保存在-20℃，效价无明显下降（2~10X10e5 cfu/μg）。
通常在质粒载体的构建完成，并测序验证后，可将重组质粒转入该感受态进行蛋白表达。该宿主菌仅为蛋白表达生产用，不可以进行载体构建和质粒的提取制备。由于 pCold-SUMO 系统的高可溶性表达特性，在大多数情况下重组蛋白在 LyophilizedArctic (DE3)感受态即可获得理想的可溶表达，因此首次实验请选用 Lyophilized Arctic (DE3)感受态宿主菌。

在 LyophilizedArctic (DE3)感受态宿主菌可溶表达效果不理想的情况下，再选用操作相对复杂的、带有辅助折叠伴侣分子的 LyophilizedBL21(DE3)Chaprone 宿主菌，该系统可获得最佳的可溶表达。除此外，pCold-SUMO 系统在常规 BL21(DE3)、BL21(DE3)plys等宿主菌内均可获得可观的可溶性表达。
关于蛋白酶的使用：试剂盒配备了 SUMO 蛋白酶（酵母来源，也称为 UIP 蛋白酶）和 rTEV 蛋白酶，在第一步载体构建过程中需要评估、考虑两个蛋白酶的使用策略。SUMO 蛋白酶识别蛋白结构，切割活性高、酶切完全，对于需要去除 Tag的重组蛋白其是。个别情况下 SUMO 标签的结构会受到 C 端重组目标蛋白的影响，使得 SUMO 蛋白酶对重组融合蛋白的切割效率降低、甚至是无效，此时再选用 rTEV 蛋白酶进行酶切。由于 rTEV 蛋白酶识别氨基酸序列，个别重组融合蛋白会包埋识别序列，因此也会导致蛋白酶切效率下降。由于重组融合蛋白结构的无法预测性，因此在实验过程中两种蛋白酶的酶切均需要测试。无论如何，通常 SUMO 蛋白酶具有更高的效率，本试剂盒配备的 SUMO 蛋白酶可以识别 SUMO标签结构（SDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG）切割位点位于 QIGG 之后。SUMO 蛋白酶含有双 His 标签，保证了 SUMO 蛋白酶高亲力的结合 Ni-NTA，以最大限度的去除 SUMO 蛋白酶（分子量约 26kD）。rTEV 蛋白酶可以识别 SUMO 标签后面的 Glu-AsnLeu-Tyr-Phe-Gln-Gly (ENLYFQG)氨基酸序列，并在识别位点 Gln-Gly(QG)之间进行切割，从而去除 SUMO 标签。rTEV 蛋白酶含有 6XHis 标签（分子量约 30kD），可使用 Ni-NTA 纯化介质去除。
本试剂盒配备的 pCold-SUMO-10His-Positive Plasmid 为蛋白表达阳性质粒，该质粒含有 43kD 的目标蛋白，其与SUMO 标签（19kD）融合后分子量约为 62kD。该表达质粒在 Arctic (DE3)中即可获得良好的表达。其可以仅可做为表达、酶切实验的阳性对照品。

 PCR反应条件优化：
1、变性温度和时间：
pCold-SUMO-10His原核蛋白表达试剂盒保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。
2、复性温度和时间:
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。
3、延伸温度和时间:
一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。
4、循环数:
其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。
图

货号	产品名称	规格
XG-P3056	pCold-SUMO-10His原核蛋白表达试剂盒	1 kit

降落PCR与温度梯度PCR的区别：
降落PCR与温度梯度PCR都是对反应体系中的退火温度进行优化，但两者在原理上有所不同。
温度梯度PCR是为了找到最适的退火温度，设置不同的退火温度进行多管PCR，将其分别放置在PCR仪中的不同温度模块进行反应，最终找到最适的退火温度，并进一步以此退火温度进行普通PCR扩增。
降落PCR是为了提高反应的特异性，通过设计一系列不断降低的退火温度，在同一PCR管内进行PCR扩增，最终获得大量的特异性扩增产物。
与温度梯度PCR相比，降落PCR更有优势。温度梯度PCR需要多次反应或多管反应找到最适的退火温度，之后还需以找到的最适退火温度再次进行PCR，才能得到较好的扩增效果，操作比较繁琐。降落PCR只需一次反应就可以获得很好的扩增效果，避免了对每对引物进行最适退火温度的优化和测定工作。
降落PCR适用于不确定引物的最适Tm值，或引物扩增效果不佳时，不了解目的模板同源性程度，使用降落PCR可以快速、特异的得到目的扩增片段。根据不同实验的需要，降落PCR还可与其它PCR方法同时使用，如实时定量降落PCR、竞争降落PCR等。
 

PCR的特点：
特异性强：使用两对引物进行扩增提高了特异性，第一轮PCR中由外引物错配产生非特异性产物，同时在第二轮PCR中内引物与错误片段配对扩增的概率极低，降低了扩增多个靶位点的可能性。
灵敏度高：进行两轮PCR扩增，可以执行更多的循环，从低拷贝样本中扩增得到足量的产物，克服了单次扩增平台期限制，提高PCR的灵敏度。

 
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