COVID 19-ORF1ab LAMP Primer Set

库存 ：42

保质期 ： 24 个月

供应商 ：上海西格

保存条件 ：-20℃

规格 ：50Tx25μl

（一）靶标基因区段（COVID-19 ORF1ab 基因）：
AACAGTGGTTGTTAATGCAGCCAATGTTTACCTTAA
ACATGGAGGAGGTGTTGCAGGAGCCTTAAATAAGG
CTACTAACAATGCCATGCAAGTTGAATCTGATGATTA
CATAGCTACTAATGGACCACTTAAAGTGGGTGGTAG
TTGTGTTTTAAGCGGACACAATCTTGCTAAACACTG
TCTTCATGTTGTCGGCCCAAATGTTAACAAAGGTGA
AGACATTCAACTTCTTAAGAGTGCTTATGAAAATTTT
AATCAGCACGAAGTTCTACTTGCACCATTATTATCAG
CTGGTATTTTTGGTGCTGACCCTAT
（二）Primer Set 形式为冻干品形态，使用 125 μl ddH2O溶解冻干引物，溶解后的浓度为 10x 浓度。
（三）阳性标准品为冻干质粒标准品，使用前加入 100 μlddH2O 混匀，溶解后浓度为 10e6 copies/μl。
（四）该引物可搭配系列进行荧光检测、红黄变色、HNB 变色实验。灵敏度为 5-25copies/test，反应时间<25min，反应温度 65℃，假阳性比例<1%。

储存：该制品-20℃，保存 24 个月，引物干粉溶解后，1个月内使用完毕。
 

 使用说明：
引物干粉溶解后为 10x 浓度，每 25 μl 反应体系使用2.5 μl。 引物溶解后，放置于-20℃以下保存。无论进行变色扩增或荧光扩增系列说明书操作即可，检测注意事项，亦参考以上三个系列的说明书。
注意：
（1）该引物组合为目前我处已知的最快检测引物。在荧光法检测中，10e4 copies/test 中，可在 5min 开始起峰，10min 内完成检测10 copies/test 可在 10-15min 开始起峰，18-20min 内完成检测
（2）用 ddH2O 浸泡的拭孖液，可直接进行检测，无需核酸进一步纯化。

货号	产品名称	规格
XG-P2970	COVID 19-ORF1ab LAMP Primer Set	50Tx25μl

PCR反应条件优化：
1、变性温度和时间：
COVID 19-ORF1ab LAMP Primer Set保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。
2、复性温度和时间:
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。
3、延伸温度和时间:
一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。
4、循环数:
其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。
 

PCR的特点：
特异性强：使用两对引物进行扩增提高了特异性，第一轮PCR中由外引物错配产生非特异性产物，同时在第二轮PCR中内引物与错误片段配对扩增的概率极低，降低了扩增多个靶位点的可能性。
灵敏度高：进行两轮PCR扩增，可以执行更多的循环，从低拷贝样本中扩增得到足量的产物，克服了单次扩增平台期限制，提高PCR的灵敏度。

 
降落PCR与温度梯度PCR的区别：
降落PCR与温度梯度PCR都是对反应体系中的退火温度进行优化，但两者在原理上有所不同。
温度梯度PCR是为了找到最适的退火温度，设置不同的退火温度进行多管PCR，将其分别放置在PCR仪中的不同温度模块进行反应，最终找到最适的退火温度，并进一步以此退火温度进行普通PCR扩增。
降落PCR是为了提高反应的特异性，通过设计一系列不断降低的退火温度，在同一PCR管内进行PCR扩增，最终获得大量的特异性扩增产物。
与温度梯度PCR相比，降落PCR更有优势。温度梯度PCR需要多次反应或多管反应找到最适的退火温度，之后还需以找到的最适退火温度再次进行PCR，才能得到较好的扩增效果，操作比较繁琐。降落PCR只需一次反应就可以获得很好的扩增效果，避免了对每对引物进行最适退火温度的优化和测定工作。
降落PCR适用于不确定引物的最适Tm值，或引物扩增效果不佳时，不了解目的模板同源性程度，使用降落PCR可以快速、特异的得到目的扩增片段。根据不同实验的需要，降落PCR还可与其它PCR方法同时使用，如实时定量降落PCR、竞争降落PCR等。
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