M-MLV III Green Two-Step qRT-PCT Kit （qPCR荧光定量Mix-染料法两步法通用试剂盒）

库存 ：21

保质期 ：12 个月

供应商 ：上海西格

保存条件 ：-20℃

规格 ：RT体系/PCR 体系20ul×50 次 /50ul×80 次

存储温度：-20℃保存。
制品说明：
 用M-MLV III和5×RT Mix能更高效地将RNA合成cDNA 。PCR使用2×Green qPCR MasterMix。本试剂盒含有从RNA到cDNA，以及qPCR扩增cDNA的全部试剂。2×Green qPCR MasterMix是专用于染料法（SYBR Green I）实时荧光定量PCR的预混体系，包含HotStar Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、SYBR Green I荧光染料、Mg2+和ROX校正染料，操作简单方便，主要用于基因组DNA靶序列和RNA反转录后cDNA靶序列的检测。
产品特点：
1.M-MLV III的RNase H活性缺失，具有更强的延伸能力，灵敏度高，特异性高，热稳定性高，可用于较长的cDNA合成以及高比例的全长cDNA文库的构建;
2.Anchored Oligo(dT)18设计独特能锚定mRNA Poly(A)+的5′端区域，退火位点锚定，特异性高，保证cDNA合成效率和成功率;
3.可用Random Primer（N9）或基因特异引物（GSP）合成第一链cDNA;
4.合成片段≤8kb;
5.本产品中使用了全新高效热启动酶HotStar Taq DNA Polymerase与独特的PCR缓冲体系，显著提高PCR的扩增效率，具有高灵敏度和特异性强的特点；
6.适用于荧光定量 PCR 检测，能够准确地对目的基因进行定量和检测；
7.本产品兼容性强，适用于不同厂家、型号的荧光定量 PCR 仪；

货号	产品名称	规格
XG-P2851	M-MLV III Green Two-Step qRT-PCT Kit （qPCR荧光定量Mix-染料法两步法通用试剂盒）	RT体系/PCR 体系20ul×50 次 /50ul×80 次

 

 PCR反应条件优化：
1、变性温度和时间：
M-MLV III Green Two-Step qRT-PCT Kit （qPCR荧光定量Mix-染料法两步法通用试剂盒）保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。
2、复性温度和时间:
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。
3、延伸温度和时间:
一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。
4、循环数:
其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。
 

PCR的特点：
特异性强：使用两对引物进行扩增提高了特异性，第一轮PCR中由外引物错配产生非特异性产物，同时在第二轮PCR中内引物与错误片段配对扩增的概率极低，降低了扩增多个靶位点的可能性。
灵敏度高：进行两轮PCR扩增，可以执行更多的循环，从低拷贝样本中扩增得到足量的产物，克服了单次扩增平台期限制，提高PCR的灵敏度。

 
降落PCR与温度梯度PCR的区别：
降落PCR与温度梯度PCR都是对反应体系中的退火温度进行优化，但两者在原理上有所不同。
温度梯度PCR是为了找到最适的退火温度，设置不同的退火温度进行多管PCR，将其分别放置在PCR仪中的不同温度模块进行反应，最终找到最适的退火温度，并进一步以此退火温度进行普通PCR扩增。
降落PCR是为了提高反应的特异性，通过设计一系列不断降低的退火温度，在同一PCR管内进行PCR扩增，最终获得大量的特异性扩增产物。
与温度梯度PCR相比，降落PCR更有优势。温度梯度PCR需要多次反应或多管反应找到最适的退火温度，之后还需以找到的最适退火温度再次进行PCR，才能得到较好的扩增效果，操作比较繁琐。降落PCR只需一次反应就可以获得很好的扩增效果，避免了对每对引物进行最适退火温度的优化和测定工作。
降落PCR适用于不确定引物的最适Tm值，或引物扩增效果不佳时，不了解目的模板同源性程度，使用降落PCR可以快速、特异的得到目的扩增片段。根据不同实验的需要，降落PCR还可与其它PCR方法同时使用，如实时定量降落PCR、竞争降落PCR等。
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