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文献和实验
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库存 :40
保质期 :12 个月
供应商 :上海西格
保存条件 :2-8°C
规格 :50 次
PCR反应条件优化:1、变性温度和时间:
高纯质粒小提中量快速提取试剂盒保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s,再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长,可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。
2、复性温度和时间:
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高,产物特异性越高。复性温度越低,产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。
3、延伸温度和时间:
一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时,过高的延伸温度不利于引物与模板的结合,可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间,可根据待扩增片段的长度而定,小于1kb, 1min足够;大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意,延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。
4、循环数:
其他参数选定后,PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后,PCR产物的积累即可达到最大值,实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%,因此不管模板浓度是多少,20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多,非特异扩增增加。
保存条件:本产品收到后按照上面指示温度存放各成份,储存18个月不影响使用效果。
产品介绍:
本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞,离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA,再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除,最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
产品特点:
1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2.独有的去蛋白液配方,可以高效去除残留的核酸酶,即使是核酸酶含量丰富的菌株如JM系列、HB101也可以轻松去除。有效防止了质粒被核酸酶降解。
3.快速、方便,不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀。获得的质粒产量高、纯度好,可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。
货号 | 产品名称 | 规格 |
XG-P2732 | 高纯质粒小提中量快速提取试剂盒 | 50 次 |
降落PCR与温度梯度PCR的区别:
降落PCR与温度梯度PCR都是对反应体系中的退火温度进行优化,但两者在原理上有所不同。
温度梯度PCR是为了找到最适的退火温度,设置不同的退火温度进行多管PCR,将其分别放置在PCR仪中的不同温度模块进行反应,最终找到最适的退火温度,并进一步以此退火温度进行普通PCR扩增。
降落PCR是为了提高反应的特异性,通过设计一系列不断降低的退火温度,在同一PCR管内进行PCR扩增,最终获得大量的特异性扩增产物。
与温度梯度PCR相比,降落PCR更有优势。温度梯度PCR需要多次反应或多管反应找到最适的退火温度,之后还需以找到的最适退火温度再次进行PCR,才能得到较好的扩增效果,操作比较繁琐。降落PCR只需一次反应就可以获得很好的扩增效果,避免了对每对引物进行最适退火温度的优化和测定工作。
降落PCR适用于不确定引物的最适Tm值,或引物扩增效果不佳时,不了解目的模板同源性程度,使用降落PCR可以快速、特异的得到目的扩增片段。根据不同实验的需要,降落PCR还可与其它PCR方法同时使用,如实时定量降落PCR、竞争降落PCR等。
PCR的特点:
特异性强:使用两对引物进行扩增提高了特异性,第一轮PCR中由外引物错配产生非特异性产物,同时在第二轮PCR中内引物与错误片段配对扩增的概率极低,降低了扩增多个靶位点的可能性。
灵敏度高:进行两轮PCR扩增,可以执行更多的循环,从低拷贝样本中扩增得到足量的产物,克服了单次扩增平台期限制,提高PCR的灵敏度。
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