碱性磷酸酶同工酶-检测试剂盒(热稳定性法)

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供应商 ：信帆生物

碱性磷酸酶同工酶检测试剂盒(热稳定性法)
产品简介：
碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，简称 ALP 或 AKP)为一类磷酸酯酶，广泛分布于
哺乳动物组织内，其活性所需最适 pH 9.2~9.8，碱性磷酸酶同工酶有肝、骨、小肠、胎盘、
胆汁等同工酶。碱性磷酸酶同工酶检测试剂盒(热稳定性法)采用磷酸苯二钠比色法，其检测原理是磷酸苯二钠在碱性条件下，可在碱性磷酸酶的作用下生成游离酚和磷酸；在碱性条件下酚与氨基安替比林结合，并经氧化生成红色醌式结构物，呈深浅不一的红色，产物红色越深说明碱性磷酸酶活性越高，反之则酶活性越低，通过比色法(分光光度计或酶标仪)测定510nm 处吸光度，据此通过比色分析就可以计算出总的碱性磷酸酶活性水平，同时通过56℃、65℃加热后测定残余 ALP 活性，以确定同工酶的性质，可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清等样品中内源性的碱性磷酸同工酶活性；如果用分光光度计，100T 的检测试剂盒可检测 25 次左右；如果用酶标仪，100T 的检测试剂盒可检测 250 次左右。该试剂盒仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。

操作步骤(仅供参考)：
1、准备样品：
①细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如果有必要可用 PBS 或生理盐水进行适当匀浆，一般细胞数量在 106 以上，组织应在 100mg 以上，3000~4000rpm 离心取上清，-20℃冻存，用于碱性磷酸酶同工酶的检测。
②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于该试剂盒的测定，尿液通常也可以直接用于测定，-20℃冻存，但为了消除样品本身颜色的干扰，需设置加了血浆或血清但不加底物的对照。
③高活性样品：如果样品中含有较高活性的碱性磷酸酶，可以使用原有的裂解液或 PBS等进行稀释，如鸡血清、血浆可稀释 5～10 倍后检测。
2、配制 ALP 显色试剂：临用前将 ALP 显色试剂 A 和 ALP 显色试剂 B 按 1:2 比例混合即可，不宜长期保存。
3、配制标准品工作液：取出 Phenol 标准(1mg/ml)恢复至室温后，取 0.1ml 溶解于 1.9ml ddH2O，即为 Phenol 标准(0.05mg/ml)。
(2)检测 ALP 同工酶：取相同样本，分别置于 56℃和 65℃水浴，准确孵育 10min，期间不断晃动使温度尽快平衡，然后立即冰浴至室温，其余操作同上。用分光光度计，以 0 号管(ddH2O)调零，读取对照管、标准管、测定管的 510nm 吸光度(即 A 对照、A 标准、A 测定)，如无法检测 510nm，亦可检测 500～530nm 范围内吸光度。
5、酶标仪测定：
(1)检测总 ALP：按照下表设置对照孔、标准孔、测定孔，溶液应按照顺序依次加入，并注
意避免产生气泡；如果样品中的碱性磷酸酯酶活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再
进行测定，样品的检测最好能设置平行孔。

计算：
碱性磷酸酶金氏活性单位的定义：在 37℃条件下，100ml 待测样品与显色底物(即 ALP
显色液所含物质)作用 15min，产生 1mg 酚为一个金氏单位(U/L)。
以系列 Phenol 标准(1～5 号管)对应的金氏单位为 x 轴，以相应的 A 标准(1～5 号管)为
y 轴，绘制标准曲线，亦可分别制作标准曲线。以 A 测定-A 对照的差值为实际的吸光度，用该差值与标准曲线进行对比，求出总 ALP、56℃加热后 ALP、65℃加热后 ALP 活性单位。
56℃加热后 ALP 残余活性百分率=56℃加热后 ALP 残余活性/总 ALP 活性×100%
65℃加热后 ALP 残余活性百分率=65℃加热后 ALP 残余活性/总 ALP 活性×100%
注意事项：
1、 待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。
2、 如果没有分光光度计，也可以使用酶标仪测定。
3、 所测样本的值高于标准曲线的上限，应稀释样品后重新测定。
4、 空白管如果显红色，说明 ALP 显色液不可用，应丢弃。
5、 加入显色基液时应迅速，并且及时混匀，否则显色不充分。
6、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：6 个月有效；4℃运输，4℃保存。

碱性磷酸酶同工酶检测试剂盒(热稳定性法)