β-淀粉酶(β-AMS)-检测试剂盒(硝基水杨酸法)

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供应商 ：信帆生物

β-淀粉酶(β-AMS)检测试剂盒(硝基水杨酸法)
产品简介：
淀粉酶(Amylase，AMS)又称1,4-α-D-葡聚糖水解酶，是水解淀粉和糖原的酶类总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶。α-淀粉酶随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶。β-淀粉酶每次从淀粉的非还原端切下一个分子的麦芽糖，因此又被称为糖化酶。
Leagene β-淀粉酶(β-AMS)检测试剂盒(硝基水杨酸法)其检测原理是α-淀粉酶和β-淀粉酶从淀粉上分解出来的麦芽糖能还原硝基水杨酸形成棕红色化合物，在540nm处有最大吸光度，通过比色法分别检测α-淀粉酶和(α+β)-淀粉酶分解淀粉产生的麦芽糖的量，以此表示酶的活力，通过差值可计算出β-淀粉酶的活力单位。α-淀粉酶不耐酸，在酸性条件下被迅速钝化；β-淀粉酶不耐热，在70℃保温15min会被钝化。本法采用先加热钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶的活力，再与非钝化条件下测定的 (α+β)-淀粉酶总活力比较，即可求出β-淀粉酶活力。用于检测植物或动物的细胞或组织裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的淀粉酶活性。该试剂盒优点是灵敏、准确、精确度高，适宜精确测量小样品β-淀粉酶活性；其缺点是测定步骤较繁，不便分析大量样品，测定范围较窄 。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

产品组成：

编号 名称	TE0209 100T	Storage
试剂(A): 麦芽糖标准(10mM)	10ml	4℃
试剂(B): β-AMS Assay buffer	50ml	4℃
试剂(C): DNS显色液	100ml	4℃ 避光
使用说明书	1份

自备材料：

1. 蒸馏水
2. 水浴锅或恒温箱
3. 比色杯或96孔板
4. 分光光度计或酶标仪
5. 离心管、离心机
6. 容量瓶

操作步骤(仅供参考)：

1. 稀释标准品并绘制标准曲线：按下表稀释麦芽糖标准(10mM)，分别获得0、0.3、0.6、1.2、1.8、2.4、3(mM)的标准液。

加入物(ml)	0	1	2	3	4	5	6
麦芽糖标准(mM)	0	0.03	0.06	0.12	0.18	0.24	0.3
蒸馏水	1.0	0.97	0.94	0.88	0.82	0.76	0.7
DNS显色液	1	1	1	1	1	1	1
麦芽糖浓度(μmol/ml)	0	0.3	0.6	1.2	1.8	2.4	3
相应麦芽糖含量(μmol)	0	0.3	0.6	1.2	1.8	2.4	3

充分混匀，置沸水浴中煮沸10min，取出后流水冷却，加蒸馏水定容至10ml，以0号管为空白调零，分光光度计或酶标仪540nm处检测吸光度，以麦芽糖含量(μmol)为横坐标，以标准管(1~6号管)吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1. 准备样品：

①细胞或组织样品：取萌发的植物种子或细胞样品(组织应取0.5g)，如果有必要需用蒸馏水进行适当匀浆，清洗匀浆器，3000r/min离心10min，上清液加入50m容量瓶中，补水定容，即为淀粉酶液Ⅰ，吸取淀粉酶液Ⅰ用蒸馏水稀释5倍，即为淀粉酶液Ⅱ，-20℃冻存，用于AMS的检测。
②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备，用蒸馏水5~10倍稀释后，可以直接用于本试剂盒的测定，尿液通常也可以直接用于测定，-20℃冻存(但为了消除样品本身颜色的干扰，可设置加了血浆或血清但不加底物的对照)。
③(选做)样品准备完毕后可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便于后续计算单位蛋白重量组织或细胞内的AMS含量。

1. AMS加样：按照下表设置Ⅰ-1、Ⅰ-2、Ⅱ-1、Ⅱ-2，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的淀粉酶活性过高，可以减少样品用量或加蒸馏水适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行管。

如果使用分光光度计，反应体系设置如下：

加入物(ml)	Ⅰ-1	Ⅰ-2	Ⅱ-1	Ⅱ-2
淀粉酶液Ⅰ	0.5	0.5	—	—
置于70℃水浴中15min，流水中迅速冷却。
淀粉酶液Ⅱ	—	—	0.5	0.5
DNS显色液(提前温浴)	1	—	1	—
混匀，40℃水浴保温10min。
AMS Assay buffer(提前温浴)	1	1	1	1
混匀，40℃水浴保温10min。
DNS显色液(提前温浴)	—	1	—	1
混匀，100℃水浴煮沸5min，流水迅速冷却。
补蒸馏水至	10	10	10	10

如果使用酶标仪，反应体系设置如下：

加入物(ml)	Ⅰ-1	Ⅰ-2	Ⅱ-1	Ⅱ-2
淀粉酶液Ⅰ	0.1	0.1	—	—
置于70℃水浴中15min，流水中迅速冷却。
淀粉酶液Ⅱ	—	—	0.1	0.1
DNS显色液(提前温浴)	0.2	—	0.2	—
混匀，40℃水浴保温10min。
AMS Assay buffer(提前温浴)	0.2	0.2	0.2	0.2
混匀，40℃水浴保温10min。
DNS显色液(提前温浴)	—	0.2	—	0.2
混匀，100℃水浴煮沸5min，流水迅速冷却。
补蒸馏水至	2	2	2	2

4、AMS测定：蒸馏水调零，分光光度计(比色杯光径1cm)或酶标仪测定540nm处Ⅰ-1、Ⅰ-2、Ⅱ-1、Ⅱ-2的吸光度，分别记为A_Ⅰ-1、A_Ⅰ-2、A_Ⅱ-1、A_Ⅱ-2。

计算：
   淀粉酶活性单位的定义：在25℃ 1min催化水解底物产生1μmol麦芽糖的酶量为一个酶活力单位。根据酶活性定义，分别计算出样品中α-AMS和(α+β) -AMS的活性，以(α+β) -AMS活力减去α-AMS活力即得β-AMS活力。
淀粉酶活力计算：根据各管吸光度值，在标准曲线上查出对应的麦芽糖含量(μmol)，再按下列公式计算α-AMS和(α+β) -AMS的活力，继而根据μmol数计算出以U为单位的活力单位。本实验中AMS活力1μmol/ml为U/ml。
     液体样品AMS活力(U/ml)=(X_l×V_T×N)/(V_S×t)
     组织AMS活力(U/mg)=(X_m×V_T×N)/(W×V_S×t)
       式中： X_l=从标准曲线查得待测样品的麦芽糖含量(μmol)
              V_T=淀粉酶液Ⅰ总体积(ml)
N=待测样品稀释倍数
V_S=测定时取用的淀粉酶液Ⅱ体积(ml)
t=反应时间(min)，本实验中该值=5
W=组织等固体样品质量(mg)

注意事项：
1、本试剂盒亦可用酶标仪进行检测，但检测的样本数相应增多。
2、待测样品中不能含有AMS抑制剂，同时需避免反复冻融。
3、酶活性在400U以下时与底物的水解量呈线性关系，如测定管的吸光度比空白管的吸光度小1倍时，应加大样品稀释倍数或减少加入待测样品的量，重新测定，测定结果应乘以稀释倍数。
4、本试剂盒亦适用于其他样品的AMS测定，尿液检测应先作10~20倍稀释后测定。
5、AMS Assay buffer如果出现浑浊或絮状物，应弃用。
6、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期：6个月有效。4℃运输，4℃保存。

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