产品详情
文献和实验
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库存 ：大量
英文名 ：Caspase 9 Activity Assay Kit(Colorimetric Method)
保质期 ： 1 年
供应商 ：北京百奥创新科技有限公司
保存条件 ：该产品可在-20°C避光条件下保存6个月。
规格 ：20 Assays/50 Assays/100 Assays
Caspase 9活性检测试剂盒(分光光度法)
产品简介
Elabscience®自主研发的 Caspase 9 Activity Assay Kit 采用分 光光度法，可用于检测细胞、组织裂解液或其它样本的 caspase 9 活性。
背景介绍
Caspase 9 又称 ICE-LAP6 或 Mch6，是细胞凋亡信号转导过 程中比较上游的一个 caspase。线粒体释放细胞色素 c 以后， Caspase 9 可以和细胞色素 c 以及 Apaf1 形成复合物，同时被 激活。激活的 caspase 9 可以激活细胞凋亡的最关键酶 caspase 3，从而促进后续的细胞凋亡信号。Caspase 9 的激活 可以通过磷酸化进行调控。
检测原理
本 caspase 9 活性检测试剂盒是基于 caspase 9 可以催化底物 Ac-LEHD-pNA 产 生 黄 色 的 pNA(p-nitroaniline) ， pNA 在 405nm 附近有强吸收，从而可以通过测定吸光度来检测 caspase 9 的活性。
Elabscience®自主研发的 Caspase 9 Activity Assay Kit 采用分 光光度法，可用于检测细胞、组织裂解液或其它样本的 caspase 9 活性。
背景介绍
Caspase 9 又称 ICE-LAP6 或 Mch6，是细胞凋亡信号转导过 程中比较上游的一个 caspase。线粒体释放细胞色素 c 以后， Caspase 9 可以和细胞色素 c 以及 Apaf1 形成复合物，同时被 激活。激活的 caspase 9 可以激活细胞凋亡的最关键酶 caspase 3，从而促进后续的细胞凋亡信号。Caspase 9 的激活 可以通过磷酸化进行调控。
检测原理
本 caspase 9 活性检测试剂盒是基于 caspase 9 可以催化底物 Ac-LEHD-pNA 产 生 黄 色 的 pNA(p-nitroaniline) ， pNA 在 405nm 附近有强吸收，从而可以通过测定吸光度来检测 caspase 9 的活性。
检测样本类型
细胞样本 组织样本
保存条件
-20°C 可保存一年。Ac-LEHD-pNA (4 mM)应适当分装并避光 保存，避免反复冻融。
自备试剂及仪器
1. 试剂
PBS、蛋白定量试剂盒（Bradford 法）。
2. 仪器
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、恒温培养箱、移液器、 研钵或匀浆器。
注意事项
1. 所有待检样本都需检测蛋白浓度，由于样本裂解液中含 有还原剂，不适合使用 BCA 法进行蛋白浓度测定，推 荐使用考马斯亮蓝法（Bradford 法）。
2. 建议在正式实验前，选择 2~3 个预期差异大的样本进行 预实验，若样本吸光值超过标准曲线的测量范围，则需 稀释样本或者调整上样量再进行测定。
3. 进行 caspase 9 活性测定的样本，其蛋白浓度应在 1~4 mg/mL，否则会影响实验结果的准确性。
4. 一次实验的细胞数目建议不低于 1×106 个，组织样本不 低于 50mg，以便达到 1~4 mg/mL 的蛋白浓度。否则会影响实验的精准度，导致蛋白浓度过低，反应体系内活 性 caspase 9 过少而 OD 值偏低。
准备工作
1. Cell Lysis Buffer 溶解后混匀，冰浴备用。
2. 2×Reaction Buffer 溶解后混匀，冰浴备用。
3. Ac-LEHD-pNA 和 pNA 溶解后混匀，冰浴备用。
样本准备
1. 细胞样本
按照常规方法收集细胞沉淀，PBS 重悬细胞并计数，600×g 离心 5 min，弃上清，按照每 100 万细胞加入 100 μL Cell Lysis Buffer 的比例加入预冷的 Cell Lysis Buffer 重悬细胞， 在冰浴条件下裂解 30 min，裂解期间需涡旋震荡 3~4 次，每 次 10 s。裂解后的样本，于 4°C，11000 ×g 离心 10~15 min， 小心地吸取上清至新的 EP 管中，并置于冰上待用。同时使 用 Bradford 法（E-BC-K168-M）测定蛋白浓度。
注：检测贴壁细胞时，需收集诱导后产生的悬浮细胞，并与 后续收集的贴壁细胞一起检测。
2. 组织样本
取 50 mg 待测组织样本，用 PBS 或者生理盐水清洗 1-2 次， 去除组织中残留的血细胞，用手术剪剪碎，加入 200 μL 预冷 的 Cell Lysis Buffer，进行匀浆（在冰浴条件下进行，若组织 质量加倍时，加入的预冷 Cell Lysis Buffer 也需加倍）。将匀浆好的样本转移至 1.5 mL 离心管中，冰浴裂解 30 min。裂解 后的样本，于 4°C，11000×g 离心 10~15 min，小心地吸取上 清至新的 EP 管中，并置于冰上待用。同时使用 Bradford 法 （E-BC-K168-M）测定蛋白浓度。
注：制备好的样本应立即测定，若无法及时测定，可将裂解 后的上清保存在-80°C，2 周内进行检测。
实验步骤
1. 制备 pNA 标准曲线（选做）
1) 配制标准品稀释液：取冰浴的 Cell Lysis Buffer 和 2×Reaction Buffer，按照 1:1 配制标准品稀释液，涡旋或 吹打混匀。
2) 进行倍比稀释：取 6 支 EP 管，第一支 EP 管中加入 294 μL 标准品稀释液，其他每管中加入 150 μL 标准品稀释液， 从 pNA (10 mM)的标准品中吸取 6 μL 到第一支 EP 管中 混匀配成 200 µM 的标准品工作液，吸取 150 μL 到第 2 支 EP 管，混匀后吸取 150 μL 到第 3 支 EP 管，按此步骤 往后依次吸取混匀至第 5 支 EP 管，如下图所示：
细胞样本 组织样本
保存条件
-20°C 可保存一年。Ac-LEHD-pNA (4 mM)应适当分装并避光 保存，避免反复冻融。
自备试剂及仪器
1. 试剂
PBS、蛋白定量试剂盒（Bradford 法）。
2. 仪器
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、恒温培养箱、移液器、 研钵或匀浆器。
注意事项
1. 所有待检样本都需检测蛋白浓度，由于样本裂解液中含 有还原剂，不适合使用 BCA 法进行蛋白浓度测定，推 荐使用考马斯亮蓝法（Bradford 法）。
2. 建议在正式实验前，选择 2~3 个预期差异大的样本进行 预实验，若样本吸光值超过标准曲线的测量范围，则需 稀释样本或者调整上样量再进行测定。
3. 进行 caspase 9 活性测定的样本，其蛋白浓度应在 1~4 mg/mL，否则会影响实验结果的准确性。
4. 一次实验的细胞数目建议不低于 1×106 个，组织样本不 低于 50mg，以便达到 1~4 mg/mL 的蛋白浓度。否则会影响实验的精准度，导致蛋白浓度过低，反应体系内活 性 caspase 9 过少而 OD 值偏低。
准备工作
1. Cell Lysis Buffer 溶解后混匀，冰浴备用。
2. 2×Reaction Buffer 溶解后混匀，冰浴备用。
3. Ac-LEHD-pNA 和 pNA 溶解后混匀，冰浴备用。
样本准备
1. 细胞样本
按照常规方法收集细胞沉淀，PBS 重悬细胞并计数，600×g 离心 5 min，弃上清，按照每 100 万细胞加入 100 μL Cell Lysis Buffer 的比例加入预冷的 Cell Lysis Buffer 重悬细胞， 在冰浴条件下裂解 30 min，裂解期间需涡旋震荡 3~4 次，每 次 10 s。裂解后的样本，于 4°C，11000 ×g 离心 10~15 min， 小心地吸取上清至新的 EP 管中，并置于冰上待用。同时使 用 Bradford 法（E-BC-K168-M）测定蛋白浓度。
注：检测贴壁细胞时，需收集诱导后产生的悬浮细胞，并与 后续收集的贴壁细胞一起检测。
2. 组织样本
取 50 mg 待测组织样本，用 PBS 或者生理盐水清洗 1-2 次， 去除组织中残留的血细胞，用手术剪剪碎，加入 200 μL 预冷 的 Cell Lysis Buffer，进行匀浆（在冰浴条件下进行，若组织 质量加倍时，加入的预冷 Cell Lysis Buffer 也需加倍）。将匀浆好的样本转移至 1.5 mL 离心管中，冰浴裂解 30 min。裂解 后的样本，于 4°C，11000×g 离心 10~15 min，小心地吸取上 清至新的 EP 管中，并置于冰上待用。同时使用 Bradford 法 （E-BC-K168-M）测定蛋白浓度。
注：制备好的样本应立即测定，若无法及时测定，可将裂解 后的上清保存在-80°C，2 周内进行检测。
实验步骤
1. 制备 pNA 标准曲线（选做）
1) 配制标准品稀释液：取冰浴的 Cell Lysis Buffer 和 2×Reaction Buffer，按照 1:1 配制标准品稀释液，涡旋或 吹打混匀。
2) 进行倍比稀释：取 6 支 EP 管，第一支 EP 管中加入 294 μL 标准品稀释液，其他每管中加入 150 μL 标准品稀释液， 从 pNA (10 mM)的标准品中吸取 6 μL 到第一支 EP 管中 混匀配成 200 µM 的标准品工作液，吸取 150 μL 到第 2 支 EP 管，混匀后吸取 150 μL 到第 3 支 EP 管，按此步骤 往后依次吸取混匀至第 5 支 EP 管，如下图所示：
3) 每管取 100 µL 不同浓度的标准品置于酶标板或比色皿中， 检测 405 nm 下 OD 值。（为保证实验结果的准确性，建 议所有的待测样本和标准品都设立复孔。）
4) 绘制标准曲线：分别以标准品浓度和对应绝对 OD 值 （每一个标准品的 OD405减去不含 pNA 的 OD405）作为 x 轴和 y 轴，使用图形软件（或 EXCEL）绘制标准曲线， 如下图所示。实测数据可能因实验条件、检测仪器等的 不同而存在差异，图中数据仅供参考。
4) 绘制标准曲线：分别以标准品浓度和对应绝对 OD 值 （每一个标准品的 OD405减去不含 pNA 的 OD405）作为 x 轴和 y 轴，使用图形软件（或 EXCEL）绘制标准曲线， 如下图所示。实测数据可能因实验条件、检测仪器等的 不同而存在差异，图中数据仅供参考。
2. Caspase 9 的活性检测
1) 取 50 μL 样本裂解液，按照下表设置反应体系。
1) 取 50 μL 样本裂解液，按照下表设置反应体系。
注意：在设置反应体系时，先加入反应液，再加入待测样 本后适当混匀，最后加入 Ac-YVAD-pNA 并混匀，所有加 液步骤注意避免气泡产生。
2) 加入 Ac-YVAD-pNA 后混匀，37°C 孵育 1~2 h，发现颜色 变化较明显时即可检测 OD405。若颜色变化不明显，可适 当延长孵育时间到 4 h。
结果计算
方法一：按照酶活性增加的百分比计算
2) 加入 Ac-YVAD-pNA 后混匀，37°C 孵育 1~2 h，发现颜色 变化较明显时即可检测 OD405。若颜色变化不明显，可适 当延长孵育时间到 4 h。
结果计算
方法一：按照酶活性增加的百分比计算
注：阴性对照为不做凋亡处理的生物学对照组。
方法二：按照酶活计算
1. 建立标准曲线：根据标准管的浓度（x，μmol/L）和吸 光度（y，减去浓度为 0 的空白管）做标准方程 y=ax+b。
2. 计算 caspase 9 酶活力: Caspase 9 酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric substrate Ac-LEHD-pNA per hour at 37°C under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底 物饱和时，在 37°C 一个小时内可以剪切 1 nmol AcLEHD-pNA 产生 1 nmol 游离的 pNA 的 caspase 9 的酶量。
方法二：按照酶活计算
1. 建立标准曲线：根据标准管的浓度（x，μmol/L）和吸 光度（y，减去浓度为 0 的空白管）做标准方程 y=ax+b。
2. 计算 caspase 9 酶活力: Caspase 9 酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric substrate Ac-LEHD-pNA per hour at 37°C under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底 物饱和时，在 37°C 一个小时内可以剪切 1 nmol AcLEHD-pNA 产生 1 nmol 游离的 pNA 的 caspase 9 的酶量。
注：
y: 标准品测定 OD 值-空白 OD 值
x: 标准品的浓度 a: 标曲的斜率 b: 标曲的截距
△A：测定孔 OD 值-空白孔 OD 值
V 反总：反应体系总体积，0.1 mL
V 样：加入的样本体积，0.05 mL
T：反应时间，h
Cpr：样本加入检测体系前的蛋白质浓度，mgprot/mL
f: 样本加入检测体系前的稀释倍数
y: 标准品测定 OD 值-空白 OD 值
x: 标准品的浓度 a: 标曲的斜率 b: 标曲的截距
△A：测定孔 OD 值-空白孔 OD 值
V 反总：反应体系总体积，0.1 mL
V 样：加入的样本体积，0.05 mL
T：反应时间，h
Cpr：样本加入检测体系前的蛋白质浓度，mgprot/mL
f: 样本加入检测体系前的稀释倍数
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