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文献和实验
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库存 ：99
供应商 ：上海辅泽商贸有限公司
保存条件 ：-20度保存
规格 ：UP05/20tests/UP05/100tests/MD01/1set/MT02/5μg*3/D675/20 nmol/D676/5nmol/D677/5nmol/L261/10ul/L261/10ul*3/L264/1tube/L264/3tubes/L265/1tube/L265/3tubes/L266/1set/L268/1 set/SG03/5assays/SG02/20μg*3/SG05/20tests/SG05/100tests/G265/1 set/G266/1 set/G267/1 set/N511/60 nmol/N512/60 nmol/S302/1g/T022/1g/T022/5g/T039/1g/OC01/1g/OC02/1g/OC06/1g/OC08/1g/OC11/1g/OC13/1g/OC14/1g/OC21/1g/OC22/1g/W201/100mg/W201/500mg/W202/100mg/W203/100mg/W204/100mg/W217/100mg/N011/100mg/N011/1g/T012/1g/GB01/25g/GB01/100g/GB02/25g/GB02/100g/GB03/25g/GB04/25g/GB04/100g/GB05/25g/GB06/25g/GB06/100g/GB09/25g/GB10/25g/GB10/100g/GB11/25g/GB12/25g/GB12/100g/GB13/25g/GB13/100g/GB14/25g/GB15/25g/GB15/100g/GB17/25g/GB17/100g/GB18/25g/GB18/100g/GB19/25g/GB19/100g/GB20/25g/GB25/25g/B043/1g/B043/5g/C008/1g/C008/5g/C020/1g/C020/5g/C321/5g/C321/25g/D045/500mg/D316/1g/D316/5g/DS06/1set/H015/1g/H015/5g/M014/1g/M014/5g/M015/1g/M015/5g/M016/1g/M016/5g/N373/1g/O001/1g/O001/5g/O003/1g/O003/5g/T461/500mg/T464/500mg/P002/1g/P002/10g/A006/500mg/A006/1g/A012/25g/A012/5g/A015/25g/A015/5g/B002/1g/B004/1g/B015/25g/B020/100mg/B021/100mg/B021/500mg/B026/100mg/B037/5g/C001/1g/C001/5g/C010/100mg/C010/1g/C002/1g/C007/1g/D008/25g/C016/10g/D027/1g/C017/15g/D041/100mg/D043/50mg/H007/1g/H209/100mg/K003/25mg/M011/5g/N010/100mg/N010/1g/N012/25g/N013/1g/N031/100mg/P003/1g/P003/5g/P004/1g/P004/5g/P007/5g/P007/25g/T003/100mg/T037/100mg/X001/1g/X001/5g/X003/1g/X003/5g/Z002/1g/Z002/5g/M012/100g/H006/5g/I001/25g/K001/50g/K001/500g/K002/50g/K002/500g/N001/500g/N003/500g/N008/500g/E010/10g/E011/50g/E013/25g/E017/25g/E017/500g/H001/500g/LD01/10 nmol/LD02/10 nmol/LD03/10 nmol/LD04/10 nmol/LD05/1set/LD06/1set
胱氨酸摄取能力检测试剂盒—Cystine Uptake Assay Kit 货号：UP05
胱氨酸摄取能力检测试剂盒
Cystine Uptake Assay Kit
商品信息
储存条件：-20度保存
运输条件：常温
检测原理
试剂盒内含的胱氨酸类似物(Cystine Analog, CA)与胱氨酸一样可以通过xCT的转运进入细胞内。细胞裂解后通过添加Reducing Agent还原CA并与检测试剂FOdA特异性反应，生成可产生荧光的物质。[专利申请中]
检测实例
xCT抑制剂Sulfasalazine, Erastin的抑制效果评价
使用本试剂盒对xCT抑制剂Sulfasalazine和Erastin的抑制效果进行评价。荧光结果显示，两种抑制剂均对胱氨酸的摄取有明显的抑制作用。
与传统方法比较
以往在胱氨酸摄取检测时一般采用同位素示踪法，下面是本试剂盒与同位素示踪法结果的比较。
常见问题Q&A
| Q1：胱氨酸类似物(CA)具体是通过哪种转运体进入细胞内的？ |
| A1：Cystine Analog是通过胱氨酸/谷氨酸转运体(xCT)进入细胞内的。 |
| Q2：目前有检测实绩的细胞有哪些？ |
| A2：下列细胞都有检测实绩： 人胶质母细胞瘤细胞, A172 人类肺泡基底上皮细胞, A549 人恶性黑色素瘤细胞, A375 人结肠癌细胞, HCT116 人肝癌细胞, HepG2 人早幼粒白血病, HL60 人纤维肉瘤细胞, HT1080 小鼠胚胎成纤维细胞, MEF 人小细胞肺癌细胞, SBC-5 人胶质瘤细胞, U-251 MG |
| Q3：胱氨酸类似物(CA)进入细胞后会被分解、代谢掉吗？ |
| A3：胱氨酸类似物(CA)的构造非常稳定，实验范围内的操作不会被分解或代谢。 |
| Q4：可以用这个试剂盒进行定量检测胱氨酸吗？ |
| A4：本试剂盒不是胱氨酸定量检测试剂盒。 |
| Q5：可以用这个试剂盒对进入细胞内的胱氨酸定量检测吗？ |
| A5：不能定量检测进入细胞内的胱氨酸，本试剂盒是针对细胞摄取胱氨酸能力的数值化检测试剂盒。 |
| Q6：样品间荧光几乎无差异时，应该如何确认改善？ |
| A6： 请检查以下五点。 1. 细胞数量发生变化。 根据细胞数或蛋白质浓度校正测量值（荧光强度）。 更多信息，请参阅常见问题9 2.胱氨酸类似物尚未完全融入细胞。 请按以下目的对说明书中各操作时间进行调整 . 在无胱氨酸培养基中培养的时间（贴壁细胞操作 3，悬浮细胞操作 4）：5 - 30 分钟。 . 胱氨酸类似物吸收时间（贴壁细胞操作 4，悬浮细胞操作 5）：30 - 60 分钟。 3.未被细胞吸收的胱氨酸类似物残留在孔中，导致本底升高。 用 PBS 重复清洗（贴壁细胞：操作 5，悬浮细胞：操作 6）。 4.工作溶液降解，背景升高。 配置工作液一段时间后，工作液中的荧光染料可能会被降解，荧光强度可能会增加。 配置工作液后不要等待太长时间。 5.细胞类型的影响 不同类型的细胞对胱氨酸的吸收能力大不相同，吸收能力低的细胞本底可能相对较高。 下图显示了不同癌细胞对胱氨酸吸收能力的差异。 如果无法通过上述措施解决本底问题，我们建议您首先考虑常见问题中列出的经过验证的细胞类型。
|
| Q7：配制CA Uptake solution时，除了不含胱氨酸的无血清培养基以外，还可以使用哪些Buffer？ |
| A7：检测HeLa细胞时，有过使用HBSS或含有0.1% Glucose PBS（+）进行配制的成功实例。 |
| Q8：如何根据细胞数量或蛋白质浓度对测量值（荧光强度）进行校正？ |
| A8：我司推荐使用下表所列的方法。 由于校正方法和时间因使用的细胞（贴壁细胞和悬浮细胞）会有所不同，请参考下表校正【使用 UP05 测量的值】。 |
| 细胞 | 贴壁细胞 | 悬浮细胞 |
| 校正方法 | 核染色(荧光法) | 蛋白质定量: BCA法 (比色法) |
| 产品 | Sodium bicinchoninate【Code:B037】 | |
| 校正进行时间 | 操作说明书在对贴壁细胞进行实验步骤操作10(测量UP05)后使用该溶液 |
操作说明书在对悬浮细胞进行实验步骤操作9使用剩余的液体进行检测 |
| 校正操作步骤 | 参考Cell count Normalization KitCode:C544]的说明书中[更换培养基方法] | 请参考UP05操作说明书中的以下实验例。(XCT 抑制剂Erastin 对胱氨酸转运体活性的抑制(悬浮细胞:HL60) |
用【UP05 测量值】与【校正方法测量值】计算修正后的荧光强度。
校正荧光强度 = 【UP05 测量值】/【校正方法测量值】。
*【UP05 测量值】 = （样品孔测量值）- （空白孔测量值）
*【校正法测量值】=（样品孔测量值）-（无细胞孔测量值）
| Q9：一般使用哪种孔板比较好？ |
| A9： 下列厂家得孔板有过检测实绩：
公司名/ 产品名/ 货号 Ibidi/ μPlate 96 well ibiTreat black S 15/ Ib89626 AGC techno glass/ EZVIEW Glass Bottom Culture Plate LB 96well/ 5866-096 Thermo Fisher/ 96 Well Black/Clear Bottom Plate, TC Surface, Pack of 10/ 165305 |
| Q10：Cystine uptake solution可以长期保存吗？ |
| A10：CA Uptake solution无法长期保存，请提前计算好用量，务必现用现配。 |
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| 产品名 |
包装 |
价格 |
货号 |
| 1 set |
3,980 |
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| 1 set |
3,980 |
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| 1 set |
3,980 |
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1、K. Hayashima, H. Katoh, "Expression of gamma-glutamyltransferase 1 in glioblastoma cells confers resistance to cystine deprivation-induced ferroptosis", J. Biol. Chem., 2022, doi:10.1016/j.jbc.2022.101703.
2、H. Chen, L. Cao, K. Han, H. Zhang, J. Cui, X. Ma, S. Zhao, C. Zhao, S. Yin, L. Fan, H. Hu, "Patulin disrupts SLC7A11-cystine-cysteine-GSH antioxidant system and promotes renal cell ferroptosis both in vitro and in vivo",
2022, Food Chem. Toxicol., doi: 10.1016/j.fct.2022.113255.
3、X. Hu, Y. He, Z. Han, W. Liu, D. Liu, X. Zhang, L. Chen, L. Qi, L. Chen, Y. Luo, Q. Li, P. Chen, Q. Wu, X. Zhu and H. Guo,
"PNO1 inhibits autophagy-mediated ferroptosis by GSH metabolic reprogramming in hepatocellular carcinoma ",
2022, Cell Death Dis., doi:10.1038/s41419-022-05448-7.
线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit 货号：MD01
线粒体自噬检测试剂盒
Mitophagy Detection Kit
商品信息
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温
特点：
● 只需添加小分子量荧光试剂即可轻松检测线粒体
● 可以使用荧光显微镜进行活细胞成像
● 可以与附着的溶酶体染色剂同时染色
试剂盒内含
产品概述
线粒体 (Mitochondria) 是细胞中重要的细胞器之一，可以为细胞活力提供能量 。近年有报道去极化线粒体的积累引起的阿尔茨海默病 (Alzheimer's Disease) 与帕金森病(Parkinson's Disease)，可能与线粒体自噬有关。线粒体自噬是一种清除机制，可以通过自噬，将氧化应激、DNA损伤因素导致功能失调的线粒体隔离包裹成自噬体(Autophagosome)，再与溶酶体 (Lysosome) 融合后降解。本试剂盒内含Mtphagy Dye (用于检测线粒体自噬) 和Lyso Dye (溶酶体染料)。Mtphagy Dye通过化学结合，固定在细胞内的线粒体上，会发出较弱的荧光。当线粒体发生自噬，损伤的线粒体会与溶酶体融合，pH会下降，变成酸性，此时Mtphagy Dye会产生较强的荧光。如想直观观察Mtphagy Dye标记的线粒体和溶酶体的结合，可联合应用试剂盒中的Lyso Dye (标记溶酶体) 进行双染。
特点：
1）只需添加小分子量荧光试剂即可轻松检测线粒体
2）可以使用荧光显微镜进行活细胞成像
3）可以与附着的溶酶体染色剂同时染色
原理
记载了本产品的检测原理和实验例的论文请看MD01论文实验例中第四篇：Live Cell Imaging of Mitochondrial Autophagy with a Novel Fluorescent Small Molecule
实验例
1.用羰基 青 化物间氯苯腙 (CCCP，一种线粒体解偶联剂) 诱导Parkin表达的HeLa细胞线粒体自噬，并通过荧光显微镜进行检测。另外，通过与线粒体染色试剂（MitoBright Deep Red:MT08）一同染色，能够区分出已发生自噬的的线粒体（白色）和未发生自噬的线粒体（紫色）（照片：右侧）。
波长：
Mtphagy Dye:561 nm (Ex)、650 LP nm (Em)
Lyso Dye:488 nm (Ex)、502-554 nm (Em)
MitoBright Deep Red:640 nm (Ex)、656-700 nm (Em)
2.荧光显微镜观察
HeLa细胞用CCCP处理，并与线粒体检测试剂（Mtphagy Dye）和线粒体染色试剂（MitoBright LT Green）共同染色，并经过一段时间（6小时）后进行检测。
<检测条件>
设备：LSM-700 Laser scanning confocal microscope (LSCM)
(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)
激发波长：
MitoBright LT Green 488 nm
Mtphagy Dye 555 nm
物镜：63x
拍摄时间：6小时
拍摄间隔：15秒
3.自噬诱导和线粒体膜电位变化关系的检测
用羰基 青 化物间氯苯腙(CCCP，一种线粒体解偶联剂)诱导Parkin表达的HeLa细胞线粒体自噬，并使用线粒体自噬检测试剂盒（Mitophagy Detection Kit：MD01）和线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1 MitoMP Detection Kit：MT09）观察荧光结果。
结果证实在未经CCCP处理的细胞中几乎未检测到线粒体自噬的发生，并且线粒体膜电位正常维持。 另一方面，在添加了CCCP的细胞中，证实了线粒体膜电位的降低（JC-1的红色荧光降低）和线粒体自噬的发生（Mtphagy染料的荧光增强）。
<实验条件>
■将Parkin质粒导入HeLa细胞
使用HilyMax（货号：H357）将Parkin质粒引入HeLa细胞中（Parkin质粒/HilyMax试剂：0.1 μg/0.2 μl）
过夜培养后进行检测。
■线粒体自噬检测
向表达Parkin的HeLa细胞中添加0.1 μmol/l Mtphagy工作溶液，并在37°C下孵育30分钟。然后将细胞用HBSS洗涤，加入10 μg/ml CCCP/MEM溶液，并在37℃下孵育2小时。在荧光显微镜下观察细胞。
■线粒体膜电位检测
将10 μg/ml的CCCP/MEM溶液添加至表达Parkin的HeLa细胞中，并在37℃下孵育1.5小时。加入4 μmol/l的JC-1工作液使其终浓度达到2 μmol/l，并在37℃下孵育30分钟。孵育后，将细胞用HBSS洗涤，加入成像缓冲液，并在荧光显微镜下观察细胞。
<检测条件>
■线粒体自噬检测
Ex：561 nm，Em：570-700 nm
■线粒体膜电位检测
绿色Ex：488 nm，Em：500-550 nm
红色Ex：561 nm，Em：560-610 nm
荧光特性
参考文献
常见问题Q&A
|
Q1: 本试剂盒和现存传统方法相比有何优势？ |
| A1: 与PH敏感并基于Keima荧光蛋白检测方法相比，本试剂为小分子荧光试剂，因此无需表达荧光蛋白。 另外，可以通过与用于普通活细胞成像的荧光试剂用相同的操作方法对其进行染色和共同观察。 |
| Q2: 使用DMSO配置后的储存液稳定性如何？ |
| A2：Mtphagy Dye、Lyso Dye均在制备后需保存在-20℃情况下可以稳定保存1个月。建议按照实验用量， 提前分装保存。 |
| Q3: 工作液稳定性如何 |
| A3: 无法保存，建议现配现用。 |
| Q4: 培养基中有酚红会影响检测吗？ |
| A4：观察的时候，如果使用共聚焦激光显微镜的话，几乎不会受到酚红的影响，但是使用落射型荧光显微 镜的话，会观察到酚红色的背景。（参照以下观察数据）因此使用落射型荧光显微镜时，请在Working solution进行染色时使用不含酚红的培养基或HBSS。
|
| Q5: 荧光显微镜推荐的滤镜是什么？ |
| A5:根据各种试剂推荐以下波长。 Mtphagy Dye：激发（500～560 nm）、发射（670～730 nm） Lyso Dye：激发（350～450 nm）、发射（500～560 nm） |
| Q6:与其他深红色染料共同染色时的注意事项。 |
| A6：Mtphagy Dye比一般的红色系荧光染料相比波长更长，所以和Deep Red的荧光染料一起染色的时候 需要特别注意。即Mtphagy Dye在500–560 nm处激发，可在670-730 nm处检测到荧光，这时与 MitoBright Deep Red的荧光检测波长重叠。因此，有必要在不激发深红色染料的波长下激发Mtphagy 染料，同时在不激发Mtphagy染料的波长下激发深红色染料。 [泄漏的情况] ① 制备仅添加了MitoBright Deep Red（没有添加Mtphagy Dye）的细胞。 ② 通过观察MitoBright Deep Red的激发/发射波长，确认是否观察到荧光（右下图）。 ③ 用Mtphagy Dye的激发/发射波长观察，确认是否观察到荧光（左下图）。 和③中，观察到来自MitoBright Deep Red的荧光（左下图）。 *如果如上所述确认荧光泄漏，请参阅以下内容。 ○调整激发/发射波长 如以上确认如图所示，MitoBright Deep Red也在Ex 561 nm处激发，因此可以将Mtphagy Dye的激发 波长更改为接近激光器或滤光片的500 nm，以使MitoBright深红色不被激发。
调整荧光强度和荧光检测灵敏度 如果MitoBright Deep Red的荧光泄漏到Mtphagy染料的观察波长中，请将观察过程中的激发强度或 灵敏度降低到未观察到荧光的水平。 然后，再确认改变后的观察条件下可以检测Mtphagy Dye的荧光。 [如何检查泄漏] 使用Mtphagy Dye，Lyso dye（溶酶体染色剂），MitoBrightLT Deep Red（线粒体染色剂） 进行三重染色时进行确认 1.在3个培养皿或孔中制备细胞。 （Mtphagy Dye、Lyso Dye、MitoBright Deep Red分别在在不同的皿或孔中进行染色） 2.向每个孔中添加Mtphagy Dye和MitoBright Deep Red。 （在无血清培养基中） 3.在37°C下孵育30分钟。 4.进行自噬诱导条件下（如饥饿培养等）进行培养。 5.向上述2.中未使用的细胞添加Lyso Dye。（在无血清培养基中） 6.在37°C下孵育30分钟。 7.观察每种试剂的激发波长和荧光波长以及荧光强度。 8.检查所用试剂以外的观察波长处的荧光是否没有泄漏。 [观察条件] Lyso Dye：Ex：350-450 nm，Em：500-560 nm Mtphagy Dye：Ex ： 500-560 nm，Em ：670-730 nm MitoBright Deep Red：Ex ：640 nm，Em ：656-700 nm |
应用
○有关描述本产品的测量原理和使用实验例的论文，请查阅参考文献4）。
○对于通过流式细胞术检测线粒体自噬的论文，请查阅参考文献1）
Mtphagy Dye试剂 货号：MT02
Mtphagy Dye
Mtphagy Dye
商品信息
储存条件：0-5度保存，避光防潮，充氮气
运输条件：室温
特点：
● 只需添加小分子量荧光试剂即可轻松检测线粒体
● 可以使用荧光显微镜进行活细胞成像
● 可以与附着的溶酶体染色剂同时染色
注意事项
如需检测线粒体自噬，可查看Mitophagy Detection Kit
如您是首次使用Mtphagy染料，建议使用以上试剂盒（内含溶酶体），使用线粒体自噬染料与溶酶体染料共染进行检测
性质
线粒体 (Mitochondria) 是细胞中重要的细胞器之一，可以为细胞活力提供能量 。近年有报道去极化线粒体的积累引起的阿尔茨海默病 (Alzheimer's Disease) 与帕金森病(Parkinson's Disease)，可能与线粒体自噬有关。线粒体自噬是一种清除机制，可以通过自噬，将氧化应激、DNA损伤因素导致功能失调的线粒体隔离包裹成自噬体(Autophagosome)，再与溶酶体 (Lysosome) 融合后降解。本试剂盒内含Mtphagy Dye (用于检测线粒体自噬) 和Lyso Dye (溶酶体染料)。Mtphagy Dye通过化学结合，固定在细胞内的线粒体上，会发出较弱的荧光。当线粒体发生自噬，损伤的线粒体会与溶酶体融合，pH会下降，变成酸性，此时Mtphagy Dye会产生较强的荧光。如想直观观察Mtphagy Dye标记的线粒体和溶酶体的结合，可联合应用试剂盒中的Lyso Dye (标记溶酶体) 进行双染。
首次使用Mtphagy染料时，建议使用包含溶酶体染色试剂（Lyso Dye）的线粒体自噬检测试剂盒（产品货号：MD01），与溶酶体共染色来检测线粒体自噬。
开发者： Dojindo Molecular Technologies, Inc.
检测原理
Mtphagy染料的线粒体自噬检测机制
有关使用Mtphagy染料的实验数据，请参见线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit（产品货号MD01）
参考文献
1) J. Koniga, C. Otta, M. Hugoa, T. Junga, A. L. Bulteaub, T. Grunea and A. Hohna, "Mitochondrial contribution to lipofuscin formation", Redox Biology, 2017, 11, 673.
2) K. Kameyama, "Induction of mitophagy-mediated antitumor activity with folate-appended methyl-β-cyclodextrin", International Journal of Nanomedicine, 2017, 12, 3433.
3) E. F. Fang, T. B. Waltz, H. Kassahun, Q. Lu, J. S. Kerr, M. Morevati, E. M. Fivenson, B. N. Wollman, K. Marosi, M. A. Wilson, W. B. Iser, D. M. Eckley, Y. Zhang, E. Lehrmann, I. G. Goldberg, M. S. Knudsen, M. P. Mattson, H. Nilsen, V. A. Bohr and K. G. Becker, "Tomatidine enhances lifespan and healthspan in C. elegans through mitophagy induction via the SKN-1/Nrf2 pathway", Scientific Reports, 2017, 7, (46208), DOI: 10.1038/srep46208.
4) H. Iwashita, S. Torii, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, S. Shimizu and K. Okuma, "Live Cell Imaging of Mitochondrial Autophagy with a Novel Fluorescent Small Molecule", ACS Chem. Biol., 2017, 12, (10), 2546.
5) Y. Feng, NB. Madungwe, CV. da Cruz Junho and JC. Bopassa, "Activation of G protein-coupled oestrogen receptor 1 at the onset of reperfusion protects the myocardium against ischemia/reperfusion injury by reducing mitochondrial dysfunction and mitophagy.", Br. J. Pharmacol., 2017, 174, (23), 4329.
6) K. M. Elamin, K. Motoyama, T. Higashi, Y. Yamashita, A. Tokuda and H. Arima, "Dual targeting system by supramolecular complex of folate-conjugated methyl-β-cyclodextrin with adamantane-grafted hyaluronic acid for the treatment of colorectal cancer.", Int. J. Biol. Macromol., 2018, doi: 10.1016/j.ijbiomac.2018.02.149.
7)S. Ikeoka and A. Kiso , "The Involvement of Mitophagy in the Prevention of UV-B-Induced Damage in Human Epidermal Keratinocytes ", J. Soc. Cosmet. Chem. Jpn., 2020, 54(3), 252.
规格性状
规格性状：
该产品为紫色至品红色固体。
NMR光谱：测试一致
处理条件
1.保存方法：冷藏，遮光，2.氮气填充，请注意吸潮
DALGreen - Autophagy Detection 细胞自噬检测试剂 货号：D675
DALGreen - 细胞自噬荧光探针
DALGreen - Autophagy Detection
商品信息
储存条件：-20度保存，避光
运输条件：室温
特点：
● 操作流程简便
● 与LC3结果一致性高
● 可以动态观察细胞自噬
产品概述
细胞自噬是细胞内损坏的蛋白质或细胞器降解和循环利用的过程。
DALGreen是一种可以进入细胞膜检测细胞自噬的小分子脂溶性荧光染料，具有在酸性环境中产生荧光的特性，可以检测到自噬体与溶酶体融合形成的自噬溶酶体。
原理
与DAPGreen和DAPRed一样，在自噬体形成的时候染料掺入细胞膜。然后当自噬体与溶酶体融合产生酸性环境时，DALGreen的荧光增强。
试剂概要
DALGreen不仅可以用荧光显微镜检测，还可以使用流式细胞仪进行检测。DAPGreen可以用荧光酶标仪进行检测，
您可以根据自己的实验条件，使用不同的仪器进行检测。
操作特点
操作流程只有一步-加入试剂
无需基因转染。只需向准备好的细胞加入DALGreen染料，即可方便快捷的进行荧光检测。
实验例
与LC3共染
对已经表达tagRFP-LC3的MEF细胞进行DALGreen共染实验。结果显示，DALGreen的染色部位与自噬体和自噬溶酶体的标记物LC3的位置高度一致。(比例尺：10 μm)
实验的详细情况请参考如下论文：
H. Iwashita,"Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux", FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.
与Lamp-1共染
对已经表达Lamp1-tagRFP的MEF细胞进行DALGreen共染实验。结果显示，DALGreen的染色部位与溶酶体膜蛋白标记物Lamp 1的位置高度一致。(比例尺：10 μm)
实验的详细情况请参考如下论文：
H. Iwashita,"Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux", FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.
ULK1/2敲除细胞的评价
将野生型MEF细胞与已经敲除自噬体膜形成有关的ULK1/2的细胞株一起用雷帕霉素(Rapamycin)和氯喹(Chloroquine)刺激后进行对比实验。结果显示，在野生型细胞中明显观察到荧光增强，而敲除了ULK1/2的细胞中基本观察不到荧光的增强。
实验的详细情况请参考如下论文：
H. Iwashita,"Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux", FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.
细胞延时成像
用DALGreen染色HeLa细胞后，按照下列条件从培养30分钟开始直至培养6小时一直对细胞染色状态进行观察。
・Nutrient Condition: 增殖型培养基
・Autophagic Condition: 不含氨基酸的培养基
<检测条件>
仪器：激光共聚焦高内涵细胞分筛系统(恒河电机株式会社: CQ1)
荧光滤光片：Ex.405 nm / Em.525/50 nm，倍率：20X
DALGreen与其它试剂的长时间染色实验的比较，可进行单一样品随时间变化的长期观察实验。
・由于DALGreen在自噬诱导/抑制剂之前加，所以可以实时观察自噬的进程。另外在不知道自噬诱导/抑制剂的作用时间情况下，与其它试剂相比，用DALGreen更加方便快捷。
每个时间组均需要单独制备样品
・MDC(Monodansylcadaverine)等其它试剂必须要在诱导后加，
需要摸索诱导/抑制剂的作用时间，因此需要准备多组实验，操作复杂，耗费更多的时间和实验材料。
与LC3的对比
HeLa细胞:①对照组，②饥饿诱导（诱导细胞自噬）组
DALGreen的荧光成像图和细胞自噬因子LC3-Ⅱ表达量结果的对比
结果
DALGreen：饥饿诱导组比Control组荧光增强；LC3-Ⅱ：饥饿诱导组比Control组LC3-Ⅱ表达量增加；
结果表明两者有良好的相关性。
自噬诱导条件
① Control：用培养基培养6小时
② 饥饿诱导：用不含氨基酸培养基培养6小时
DALGreen的显色条件
细胞：HeLa细胞
检测波长：Ex. 488 nm/Em. 500-563 nm
比例尺：20 μm
与MDC的对比
结果
DALGreen和MDC结果：饥饿诱导组均比Control组荧光增强；结果表明两者有良好的相关性。
波长
因为MDC的最大激发波长在紫外区，所以不能用488 nm激发。DALGreen可以采用488 nm激发。
操作
DALGreen：加染料⇒饥饿诱导
MDC ：饥饿诱导⇒加染料
由于DALGreen是在饥饿诱导前加入，因此可以动态观察到细胞自噬的过程。
常见问题Q&A
| Q1: DALGreen Working Solution的稳定性如何？ |
| A1: 无法长期保存，需要现配现用 |
| Q2: DMSO Stocking Solution 的稳定性如何？ |
| A2:配制后请于-20℃保存，一个月内可保持稳定。另外建议根据用量分装保存。 |
| Q3:如何摸索DALGreen的最佳浓度？ |
| A3 :由于本试剂的特性，如果试剂的浓度太高或太低都会导致诱导自噬的样品组与未诱导自噬的对照组之间的差别不明显。建议参考以下信息摸索试剂的最佳浓度： DALGreen的最佳浓度根据细胞的种类而不尽相同。 可以考虑从最低浓度(可以0.1 μmol/l作为参考)开始分别多个梯度至最高浓度(可以4 μmol/l作为参考)的步骤进行摸索。 参考例 我们公司对HeLa, HepG2, CHO细胞的最佳浓度进行了摸索。DALGreen以下列浓度进行染色，并在无氨基酸的培养基中培养以诱导自噬。下表中红色字体的浓度可明显观察到实验组与空白组的差异。 |
| 细胞种类 |
DALGreen浓度 |
|||
| HeLa |
4 μmol/l |
2 μmol/l |
1 μmol/l |
0.5 μmol/l |
| HepG2 |
4 μmol/l |
2 μmol/l |
1 μmol/l |
0.5 μmol/l |
| CHO |
4 μmol/l |
2 μmol/l |
1 μmol/l |
0.5 μmol/l |
| Q4: 这个产品和溶酶体染色试剂有什么区别吗？ |
| A4:溶酶体染色试剂会定位于细胞内的溶酶体里。而DALGreen是在进入自噬小体后，当自噬小体与溶酶体结合后，荧光变强。 因此当溶酶体染色试剂和DALGreen共染时，溶酶体染色试剂发出的荧光与自噬小体的部分DALGreen的荧光发生重叠。 本实验的数据，请参考下面论文的Supporting Information (Fig.S5)。 H. Iwashita, "Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux", FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567. 论文的原文链接在本产品的网站页面上。 网站链接(日语)： http://dominoweb.dojindo.co.jp/goodsr7.nsf/View_Display/D675?OpenDocument |
| Q5:推荐使用的滤光片？ |
| A5:激发波长：350~450 nm; |
| Q6:是否有与自噬相关的蛋白质敲除和评估的实例？ |
| A6:与自噬小体成膜有关的ULK1和ULK2敲除的细胞与野生型细胞饥饿诱导，用DALGreen染色后评价的实例是有的。 实验结果显示，与ULK1/ULK2敲除的细胞相比，野生型细胞中的DALGreen荧光信号增大。这次实验的具体数据请参照下面这篇论文的Supporting Information (Fig. S5) 另外，自噬的标记物LC3-RFP与DALGreen的共染色结果显示，大多数的染色Puncta(斑点，位点)都高度一致。本实验的数据，请参考下面论文的Fig.1。 H. Iwashita, "Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux", FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567. 论文的原文链接在本产品的网站页面上。 网站链接(日语)： http://dominoweb.dojindo.co.jp/goodsr7.nsf/View_Display/D675?OpenDocument |
| Q7:自噬有哪些途径？DALGreen可以检测到哪些状态？ |
| A7:众所周知，自噬根据其分子机制可以分为两种：一种是依赖于ATG5的传统自噬(LC3发生变化），另一种则是非依赖于ATG的选择性自噬（LC3形式的转化并未发生）。 DALGreen在形成自噬体膜时掺入其中，当形成自噬溶酶体时，环境变成酸性，DALGreen荧光增强。因此，DALGreen可以检测自噬溶酶体的状态。 *参考资料：发现新的自噬机制Shigeomi Shimizu https://www.dojindo.co.jp/letterj/160/review/01.html 文献链接：http://dx.doi.org/10.14348/molcells.2018.2215 ▶对于首次检测的细胞类型和实验条件，请参考FAQ[如何确定细胞自噬探针DALGreen的最佳浓度]。 |
| Q8:在进行延时成像时有什么要注意的地方吗？ |
| A8:为了确定最佳实验条件，请先进行预实验。 由于试剂的特性，刚刚染色后有荧光值升高的趋势，因此请参照以下步骤进行预实验和延时成像。
※条件可能因细胞种类而异 1. 预实验 - 使用对照细胞(不诱导自噬的细胞)。 - 根据说明书的步骤用Working Soluiton染色后，用培养基洗涤2次。 - 加入正常培养基后，观察荧光随时间的变化。 - 如下图所示，染色后的细胞在荧光强度阶段性降低之后，确认荧光强度变化趋于稳定的时间段（图中的T）。 ※条件可能因细胞种类而异。 (参考) HeLa细胞的话，染色后约60分钟后，荧光确定会趋于稳定(DALGreen)。
2. 延时染色成像 - 细胞用Working Solution染色后，在培养基中37℃培养。 ※培养时间为预实验中摸索出的染色时间。 ※染色后不要立刻进行自噬诱导。 -培养后进行自噬诱导并开始延时染色成像。 (参考) 用DALGreen对HeLa细胞进行染色，在正常的培养基中培养60分钟(预实验中摸索的时间)后，进行自噬诱导。 |
参考文献
| No. |
检测样品 |
检测仪器 |
引用(含链接) |
| 1) |
细胞 |
荧光显微镜 |
H. Iwashita, H. T. Sakurai, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, K. Okuma, S. Shimizu, and Y. Ueno, "Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux.", FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567. |
| 2) |
细胞 |
荧光显微镜 |
T. Sakata, A. Saito and H. Sugimoto, "In situ measurement of autophagy under nutrient starvation based on interfacial pH sensing.", Scientific Reports., 2018, 8, 8282. |
| 3) |
细胞 |
荧光显微镜 |
Y. Egawa, C. Saigo, Y. Kito, T. Moriki and T. Takeuchi , "Therapeutic potential of CPI-613 for targeting tumorous mitochondrial energy metabolism and inhibiting autophagy in clear cell sarcoma.", PLoS One., 2018, 13, (6), e0198940. |
| 4) |
细胞 |
荧光显微镜 |
S. Abe, S. Hirose, M. Nishitani, I. Yoshida, M. Tsukayama, A. Tsuji and K. Yuasa , "Citrus peel polymethoxyflavones, sudachitin and nobiletin, induce distinct cellular responses in human keratinocyte HaCaT cells.", Biosci. Biotechnol. Biochem. ., 2018, 82, (12), 1347. |
| 5) |
细胞 |
荧光显微镜 |
W. Yuping, M. Congshun, Z. Huihui, Z. Yuxia, C. Zhenguo and W. Liping, "Alleviation of endoplasmic reticulum stress protects against cisplatin-induced ovarian damage.", Reprod. Biol. Endocrinol., 2018,doi: 10.1186/s12958-018-0404-4. |
| 6) |
细胞 |
荧光显微镜 |
S. Xue, F. Mao, D. Hu, H. Yan, J. Lei, E. Obeng, Y. Zhou, Y. Quan, and W. Yu, "Acetylation of BmAtg8 inhibits starvation-induced autophagy initiation.", Mol. Cell Biochem., 2019,doi: 10.1007/s11010-019-03513-y. |
| 7) |
细胞 |
荧光显微镜 |
F. Hongbao,Y. Shankun, C. Qixin, L. Chunyan, C. Yuqi, G. Shanshan, B. Yang, T. Zhiqi, L. Z. Amanda, T. Takanori, C.Yuncong, G. Zijian, H. Weijiang and D. Jiajie , "De Novo-Designed Near-Infrared Nanoaggregates for Super-Resolution Monitoring of Lysosomes in Cells, in Whole Organoids, and in Vivo.", ACS Nano, 2019, 13, (12), 1446. |
| 8) |
细胞 |
流式细胞仪 |
E. Sasabe, A. Tomomura, N. Kitamura and T. Yamamoto, "Metal nanoparticles-induced activation of NLRP3 inflammasome in human oral keratinocytes is a possible mechanism of oral lichenoid lesions.", Toxicol In Vitro., 2020, 62, 104663. |
| 9) |
细胞 |
荧光显微镜 |
J. Xia, Y. He, B. Meng, S. Chen, J. Zhang, X. Wu, Y. Zhu, Y. Shen, X. Feng, Y. Guan, C. Kuang, J. Guo, Q. Lei, Y. Wu, G. An, G. Li, L. Qiu, F. Zhan and W. Zhou, "NEK2 induces autophagy-mediated bortezomib resistance by stabilizing Beclin-1 in multiple myeloma.", Mol Oncol, 2020, DOI: 10.1002/1878-0261.12641. |
| 10) |
细胞 |
荧光显微镜 |
Q. Xu, W. Shi, P. Lv, W. Meng, G. Mao, C. Gong, Y. Chen, Y. Wei, X. He, J. Zhao, H. Han, M. Sun and K. Xiao, "Critical role of caveolin-1 in aflatoxin B1-induced hepatotoxicity via the regulation of oxidation and autophagy.", Cell Death Dis., 2020, 11(1), 6. |
| 11) |
细胞 |
荧光显微镜 |
L Cui, LP Zhao, JY Ye, L Yang, Y Huang, X.P. Jiang, Q. Zhang, JZ. Jia, DX. Zhang and Y. Huang, "The Lysosomal Membrane Protein Lamp2 Alleviates Lysosomal Cell Death by Promoting Autophagic Flux in Ischemic Cardiomyocytes.", Front Cell Dev Biol, 2020,DOI:10.3389/fcell.2020.00031. |
| 12) |
细胞 |
荧光显微镜 |
Y Yang, J Huang, J Li, H Yang and Y. Yin, "The Effects of Butyric Acid on the Differentiation, Proliferation, Apoptosis, and Autophagy of IPEC-J2 Cells..", Curr. Mol. Med., 2020, 20(4), 307. |
| 13) |
细胞 (成纤维细胞、肾脏上皮细胞) |
荧光显微镜 |
M. M. Ivanova, J. Dao, N. Kasaci, B. Adewale, J. Fikry and O. G. Alpan , "Rapid Clathrin-Mediated Uptake of Recombinant α-Gal-A to Lysosome Activates Autophagy", Biomolecules , 2020, 10(6), 837. |
| 14) |
细胞 (NHEKs) |
荧光显微镜 |
S. Ikeoka and A. Kiso , "The Involvement of Mitophagy in the Prevention of UV-B-Induced Damage in Human Epidermal Keratinocytes ", J. Soc. Cosmet. Chem. Jpn., 2020, 54(3), 252. |
| 15) |
细胞 |
荧光显微镜(超分辨率) |
Q. Chen, M. Hao, L. Wang, L. Li, Y. Chen, X. Shao, Z. Tian, R. A. Pfuetzner, Q. Zhong, A. T. Brunger, J. Guan and J. Diao,"Prefused lysosomes cluster on autophagosomes regulated by VAMP8", 2021, doi:10.1038/s41419-021-04243-0. |
| 16) |
细胞 （UM-SCC-104 HPV16-positive OSCC cells） |
荧光显微镜 |
Hideo Shigeishi, Masaru Sugiyama, Misaki Akagi, Yoshino Kaneyasu, Tomoko Maehara, Kouji Ohta，"HPV16 E6 and E7 are involved in inhibition of autophagy and maintenance of cancer stem cell properties in HPV16-positive oral squamous cell carcinoma cells"，Oral Science International.,2023,doi:org/10.1002/osi2.1205 |
DAPGreen - Autophagy Detection 细胞自噬检测试剂 货号：D676
DAPGreen - 细胞自噬荧光探针
DAPGreen - Autophagy Detection
商品信息
储存条件：-20度保存，避光
运输条件：室温
特点：
● 操作流程简便
● 与LC3结果高度一致
● 可以动态观察细胞自噬
产品概述
DAPGreen是一种小分子荧光染料，可以用来检测自噬体及自噬溶酶体。由于其特殊的结构，在自噬体形成双
层膜结构时染料可以进入其中，并在疏水环境中产生荧光。DAPGreen具有很好的细胞透膜性，通过荧光显微
镜可进行活细胞荧光成像，也可使用流式细胞仪进行定量检测。
原理
当形成自噬体膜时，DAPGreen可以掺入其中，并在脂溶性环境中产生荧光。
DAPGreen的检测结果与细胞自噬标志物LC3的结果有很高的相关性。
试剂概要
DAPGreen不仅可以用荧光显微镜检测，还可以使用流式细胞仪进行检测。
同时也实现了用荧光酶标仪进行检测，您可以根据自己的实验条件，使用不同的仪器进行检测。
*DAPGreen和DALGreen不能共染
操作简便
操作流程只有一步-加入试剂
只需向准备好的细胞加入DAPGreen染料，即可方便快捷的进行荧光检测。
实验例
与LC3高度相关
与自噬标准物LC3的细胞共染实验结果的比较。
检测条件：DAPGreen：Ex. 488 nm / Em. 500-563 nm
比例尺：10 μm
将DAPGreen加入已表达tagRFP-LC3的Hela细胞中，用雷帕霉素（Rapamycin）诱导自噬4 h后，用共聚焦显微镜观察DAPGreen和RFP的荧光成像。结果DAPGreen与tagRFP-LC3的染色部位高度一致。
与Lamp-1共染 
对已经表达Lamp1-tagRFP的MEF细胞进行DAPGreen共染实验。结果显示，DAPGreen的染色部位与溶酶体膜蛋白标记物Lamp 1的位置高度一致。(比例尺：10 μm)
实验的详细情况请参考如下论文：
"Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux", FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.
流式细胞仪的定量分析
自噬诱导后，通过流式细胞仪检测DAPGreen的荧光。
检测条件：
检测波长：Ex. 488 nm / Em. 500-560 nm
DAPGreen染色HeLa细胞后，在不含氨基酸的培养基中培养0、3和6 h，用流式细胞仪检测。结果，在饥饿诱导3 h后可以检测到更强的荧光信号。
荧光酶标仪的定量检测
用荧光酶标仪检测自噬诱导后DAPGreen的荧光。
检测条件
检测波长：Ex. 450 nm / Em. 535 nm
DAPGreen染色HeLa细胞后，在不含氨基酸的培养基中分别培养0、2、4、6 h，用荧光酶标仪检测。结果饥饿诱导2 h检测荧光，饥饿诱导组的荧光强度大约是对照组的3.5倍。
有关检测操作的详细信息，请参考FAQ“使用荧光酶标仪进行定量分析的检测条件是什么？”。
应用例：荧光显微镜的数值化
96孔板中接种HeLa细胞，并用DAPGreen染色后，分别更换含有血清和不含血清的培养基后继续培养。培养后分别通过视野内的平均荧光强度进行计算。结果发现，不含血清的培养基培养的细胞中DAPGreen的荧光强度更高。
<检测条件>
Ex：488 nm, Em: 500-550 nm
物镜： CFI Plan Apochromat VC 20x
拍摄模式： Resonant Scanner
XY分辨率：512x512
<使用装置>
荧光显微镜：Nikon 激光共聚焦显微镜A1R
分析软件：NIS-Elements
＜实验步骤＞
1. 将HeLa细胞播种于96孔板中并培养。
2. 去除培养基，用无血清培养基清洗1次。
3. 添加配置好的DAPGreen working solution ，37℃ 培养30 min。
4. 去除培养基，用无血清培养基清洗2次。
5. 诱导自噬的孔中加入无血清培养基，正常孔中加入正常培养基。37℃培养6小时(之后用4%PFA固定)。
6. 荧光显微镜观察。
按上述条件拍摄后，再用100倍物镜放大后拍摄，对细胞内的DAPGreen的荧光信号进行统计。结果显示，含有血清的培养基培养的细胞中平均每个细胞有1.5个信号，而不含血清的培养基培养的细胞中平均每个细胞有27个信号。
<检测条件>
Ex : 488 nm, Em : 500-550 nm
物镜： CFI Plan Apochromat TIRF 100xC Oil
拍摄模式： Galvano Scanner
XY分辨率：512x512
<使用装置>
荧光显微镜：Nikon 激光共聚焦显微镜A1R
分析软件：NIS-Elements
*本数据由DAPGreen的使用客户友情提供。
DAPGreen荧光光谱
激发滤光片：425-475 nm
荧光滤光片：500-560 nm
常见问题Q&A
| Q1: DAP Green working solution的稳定性如何？ |
| A1：无法长期保存，需要现配现用 |
| Q2: DMSO stocking solution 的稳定性如何？ |
| A2：配制后请于-20℃保存，一个月内可保持稳定。另外建议根据用量分装保存。 |
| Q3: 推荐使用的滤光片？ |
| A3：激发波长：425-475 nm 发射波长：500-560 nm 利用激光共聚焦显微镜的488 nm激发波长也可以检测，请参考我们公司网站产品页面的实验例。 |
| Q4: 在进行延时成像时有什么要注意的地方吗？ |
| 4：为了确定最佳实验条件，请先进行预实验。 由于试剂的特性，刚刚染色后有荧光值升高的趋势，因此请参照以下步骤进行预实验和延时成像。
1. 预实验 使用对照细胞(不诱导自噬的细胞)。 根据说明书的步骤用 Working Soluiton染色后，用培养基洗涤2次。 加入正常培养基后，观察荧光随时间的变化。 如下图所示，染色后的细胞在荧光强度阶段性降低之后，确认荧光强度变化趋于稳定的时间段（图中的T）。 ※条件可能因细胞种类而异。 (参考) HeLa细胞染色约60分钟后，荧光会趋于稳定(DAPGreen)。
2. 延时染色成像 - 细胞用Working Solution染色后，在培养基中37℃培养。 ※培养时间为预实验中摸索出的染色时间。验中摸索出的染色时间。 ※染色后不要立刻进行自噬诱导。 -培养后进行自噬诱导并开始延时染色成像。 (参考) 用DAPGreen对HeLa细胞进行染色，在正常的培养基中培养60分钟(预实验中摸索的时间)后，进行自噬诱导。
|
| Q5: 如何确定细胞自噬探针DAPGreen的最佳浓度？ |
| A5: 由于本试剂的特性，如果试剂的浓度太高或太低都会导致诱导自噬的样品组与未诱导自噬的对照组之间的差别不明显。建议参考以下信息摸索试剂的最佳浓度： 探针的最佳浓度根据细胞的种类而不尽相同。以DAPGreen为例可以考虑从最低浓度(可以以0.05 μmol/l作为参考)开始分别多个梯度至摸索至最高浓度(可以以0.4 μmol/l作为参考)的步骤进行摸索。
参考例： 我们公司对HeLa, HepG2, CHO细胞的最佳浓度进行了摸索。DAPGreen以下列浓度进行染色，并在无氨基酸的培养基中培养以诱导自噬。下表中红色字体的浓度可明显观察到实验组与空白组的差异。 [HeLa细胞]
<检测条件>放大倍率：20倍； 激发波长：Ex：488 nm；发射波长：Em：500-563 nm [HepG2细胞]
<检测条件>放大倍率：20倍； 激发波长：Ex：488 nm；发射波长：Em：500-563 nm [CHO细胞]
<检测条件>放大倍率：20倍； 激发波长：Ex：488 nm；发射波长：Em：500-563 nm |
| 细胞种类 | DAPGreen浓度 | |||
| Hela | 0.4 μmol/l | 0.2 μmol/l | 0.1 μmol/l | 0.05 μmol/l |
| HepG2 | 0.4 μmol/l | 0.2 μmol/l | 0.1 μmol/l | 0.05 μmol/l |
| CHO | 0.4 μmol/l | 0.2 μmol/l | 0.1 μmol/l | 0.05 μmol/l |
| Q6: 使用荧光酶标仪进行定量分析的检测条件是什么？ |
| A6:以下是使用HeLa细胞进行检测的实验例。 将DAPGreen染色的HeLa细胞在不含氨基酸的培养基中分别培养0、2、4、6 h，用荧光酶标仪检测。 <操作> 1）将细胞接种在透明底的黑板上（HeLa细胞，1.6×104 cells/孔，100 µl/孔） 2）在37°C，5％ CO2培养箱过夜培养 3）去除上清液后，在培养基中加入100 µl配制好的Working Solution(DAPGreen：0.1 µmo/l）。 4）在37°C，5％ CO2培养箱培养30 min 5）用100 µl培养基清洗细胞2次 6）加入100 µl饥饿培养基（Waco，Code：048-33575） 7）在37°C下培养各时间点 8）用荧光酶标仪（TECAN，Infinite Pro M200）检测（Ex/Em = 450 nm/530 nm） （0 h对照组用HBSS代替检测） <检测条件>波长：Ex. 450 nm/Em. 535 nm 饥饿诱导2 h检测荧光，确认到饥饿诱导组的荧光强度大约是对照组的2.5倍。 |
| Q7: 自噬有哪些途径？DAPGreen可以检测到哪些状态？ |
| A7:众所周知，自噬根据其分子机制可以分为两种：一种是依赖于ATG5的传统自噬(LC3发生变化），另一种则是非依赖于ATG的选择性自噬（LC3形式的转化并未发生）。 当形成自噬体膜时，DAPGreen可以掺入其中，并在脂溶性环境中产生荧光。因此DAPGreen可以检测自噬体的状态。 *参考资料：发现新的自噬机制Shigeomi Shimizu https://www.dojindo.co.jp/letterj/160/review/01.html 文献链接：http://dx.doi.org/10.14348/molcells.2018.2215 ▶对于首次检测的细胞类型和实验条件，请参考FAQ[如何确定细胞自噬探针DAPGreen的最佳浓度]。 |
参考文献
| No. | 检测样品 | 检测仪器 | 引用(含链接) |
| 1) | 细胞 | 荧光显微镜 | H. Iwashita, H. T. Sakurai, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, K. Okuma, S. Shimizu, and Y. Ueno, "Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux.", FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567. |
| (HeLa, MEF) | |||
| 2) | 细胞 | 荧光显微镜;流式细胞仪 | L. Hu, T. Zhang, D. Liu, G. Guan, J. Huang, P. Proksch, X. Chen and W. Lin, "Notoamide-type alkaloid induced apoptosis and autophagy via a P38/JNK signaling pathway in hepatocellular carcinoma cells", RSC Adv., 2019, 9, 19855. |
| (HepG2; Huh-7) | |||
| 3) | 细胞 | 荧光显微镜 | Q. Chu, S. Zhang, M. Chen, W. Han, R. Jia, W. Chen and X. Zheng, "Cherry Anthocyanins Regulate NAFLD by Promoting Autophagy Pathway", Oxid Med Cell Longev., 2019,DOI:10.1155/2019/4825949. |
| (HepG2) | |||
| 4) | 细胞 | 荧光显微镜 | K. Koike, E. V. Berdyshev, A. M. Mikosz, I. A. Bronova, A. S. Bronoff, J. P. Jung, E. L. Beatman, K. Ni, D. Cao, A. K. Scruggs, K. A. Serban and I. Petrache, "Role of Glucosylceramide in Lung Endothelial Cell Fate and Emphysema", Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2019,DOI:10.1164/rccm.201812-2311OC. |
| (HLMVEC) | |||
| 5) | 细胞 | 荧光显微镜 | F. Hongbao,Y. Shankun, C. Qixin, L. Chunyan, C. Yuqi, G. Shanshan, B. Yang, T. Zhiqi, L. Z. Amanda, T. Takanori, C.Yuncong, G. Zijian, H. Weijiang and D. Jiajie , "De Novo-Designed Near-Infrared Nanoaggregates for Super-Resolution Monitoring of Lysosomes in Cells, in Whole Organoids, and in Vivo.", ACS Nano, 2019, 13, (12), 1446. |
| (HeLa) | |||
| 6) | 细胞 | 流式细胞仪 | B. Yang, L. Ding, Y. Chen and J. Shi, "Augmenting Tumor-Starvation Therapy by Cancer Cell Autophagy Inhibition", Adv. Sci., 2020,DOI:10.1002/advs.201902847. |
| (HeLa; A375) | |||
| 7) | 细胞 | 荧光显微镜(超分辨率) | Y. Tan, L. Yin, Z. Sun, S. Shao, W. Chen, X. Man,Y. Du and Y. Chen, "Astragalus polysaccharide exerts anti-Parkinson via activating the PI3K/AKT/mTOR pathway to increase cellular autophagy level in vitro.", Int. J. Biol. Macromol., 2020, DOI:10.1016/j.ijbiomac.2020.02.282. |
| (PC12) | |||
| 8) | 细胞 | 荧光显微镜 | J. Kim, W.Y.Chee, N. Yabuta, K. Kajiwara, S. Nada and M. Okada, "Atg5-mediated autophagy controls apoptosis/anoikis via p53/Rb pathway in naked mole-rat fibroblasts", Biochem. Biophys. Res. Commun., 2020, 22, DOI:10.1016/j.bbrc.2020.05.083. |
| (Wild type Hepa 1-6) | (用ImageJ软件数值化) | ||
| 9) | 细胞 | 流式细胞仪 | J. Kim, W.Y.Chee, N. Yabuta, K. Kajiwara, S. Nada and M. Okada, "Atg5-mediated autophagy controls apoptosis/anoikis via p53/Rb pathway in naked mole-rat fibroblasts", Biochem. Biophys. Res. Commun., 2020, 22, DOI:10.1016/j.bbrc.2020.05.083. |
| (小鼠皮肤成纤维细胞) | |||
| 10) | 细胞 | 荧光显微镜(超分辨率) | Riccardo Trapannone, Julia Romanov，Sascha Martens，"p62 and NBR1 functions are dispensable for aggrephagy in mouse ESCs and ESC-derived neurons"，Life Science Alliance，2023，http://doi.org/10.26508/lsa.202301936 |
| (HeLa) | |||
| 11) | 细胞 | 荧光显微镜(超分辨率) | Q. Chen, M. Hao, L. Wang, L. Li, Y. Chen, X. Shao, Z. Tian, R. A. Pfuetzner, Q. Zhong, A. T. Brunger, J. Guan and J. Diao, "Prefused lysosomes cluster on autophagosomes regulated by VAMP8",2021, doi:10.1038/s41419-021-04243-0. |
| (HeLa) | |||
| 12） | 细胞（HepG2 cells） | 荧光显微镜(超分辨率) | Fei Huang a 1, Yu Li a 1, Xing-Jie Zhang a 1, Mei-Yu Lin a, Gui-Yan Han b, Hui-Ying Lin d, Hui-Yun Lin d, Zhenyuan Miao a, Bu-Hong Li c, Chun-Quan Sheng a, Jian-Zhong Yao，“Novel chlorin e6-based conjugates of tyrosine kinase inhibitors: Synthesis and photobiological evaluation as potent photosensitizers for photodynamic therapy”European Journal of Medicinal Chemistry，2023，https://doi.org/10.1016/j.ejmech.2023.115787 |
| 13) | 细胞（trophoblast cells） | 流式细胞仪 | Min Chen, Jia-Lu Shi,Zi-Meng Zheng,Zhi Lin, Ming-Qing Li, and Jun Sha，"An abnormal LPA/LPAR1-NHE1 axis leads to the autophagy deficiency of trophoblast cells in recurrent spontaneous abortion",REPRODUCTION,2023,doi.org/10.1530/REP-23-0224 |
DAPRed - Autophagy Detection 细胞自噬检测试剂 货号：D677
细胞自噬检测试剂盒
DAPRed - Autophagy Detection
商品信息
储存条件：0-5度保存，避光
运输条件：室温
特点：
● 操作流程简便
● 与LC3结果高度一致
● 可以动态观察细胞自噬
产品概述
细胞自噬是细胞内损坏的蛋白质或细胞器降解和循环利用的过程。
DAPRed是一种小分子荧光染料，可以用来检测自噬体及自噬溶酶体。由于其特殊的结构，在自噬体形成双层膜结构时染料可以进入其中，并在疏水环境中产生荧光。
DAPRed可以进入自噬体膜而发出荧光；而DALGreen可以在自噬溶酶体产生阶段发出荧光。因此DAPRed，DALGreen可以检测从自噬体的形成到自噬溶酶体的融合以及内容物分解的整个过程。
原理
当形成自噬体膜时，DAPRed可以掺入其中，并在脂溶性环境中产生荧光。
DAPRed的检测结果与细胞自噬标志物LC3的结果有很高的相关性。
试剂概要
使用前，请确认所用仪器可以检测到的荧光特性。
操作简便
操作流程只有一步-加入试剂
无需基因转染。只需向准备好的细胞加入DAPRed染料，即可方便快捷的进行荧光检测。
实验例
DAPRed和DAL Green的共染
用自噬体荧光试剂DAPRed和自噬溶酶体荧光试剂DALGreen对HeLa细胞进行共染后，通过饥饿培养诱导自噬。
·结果
在不含氨基酸的培养基中培养的HeLa细胞，DAPRed和DALGreen荧光增强。
·检测条件
DAPRed：EX. 561 nm / Em. 600-700 nm
DALGreen：EX. 488 nm / Em. 500-563 nm
比例尺 ：20 μm
·自噬诱导条件
用DAPRed和DALGreen染色后的HeLa细胞分别在增殖型培养基和不含氨基酸的培养基中培养5 h后，用共聚焦显微镜观察。
DAPRed荧光光谱
常见问题Q&A
| Q1: DAPRed Working Solution的稳定性如何？ |
| A1: 无法长期保存，需要现配现用 |
| Q2: DAPRed DMSO Stocking Solution的稳定性如何？ |
| A2: 配制后请于-20℃保存，一个月内可保持稳定。另外建议根据用量分装保存。 |
| Q3: 推荐使用的滤光片？ |
| A3: 推荐的滤光片如下： 激发波长：500-560 nm 发射波长：690-750 nm |
| Q4: 如何确定细胞自噬探针DAPRed的最佳浓度？ |
| A4:由于本试剂的特性，如果试剂的浓度太高或太低都会导致诱导自噬的样品组与未诱导自噬的对照组之间的差别不明显。建议参考以下信息摸索试剂的最佳浓度： 探针的最佳浓度根据细胞的种类而不尽相同。以DAPRed为例可以考虑从最低浓度(可以以0.05μmol/l作为参考)开始分别多个梯度至摸索至最高浓度(可以以0.4 μmol/l作为参考)的步骤进行摸索。
参考例 我们公司对HeLa, HepG2, CHO细胞的最佳浓度进行了摸索。DAPRed以下列浓度进行染色，并在无氨基酸的培养基中培养以诱导自噬。下表中红色字体的浓度可明显观察到实验组与空白组的差异。
[HeLa细胞]
<检测条件>放大倍率：20倍； 激发波长：Ex：561 nm；发射波长：Em：600-700 nm
[HepG2细胞]
<检测条件>放大倍率：20倍； 激发波长：Ex：561 nm；发射波长：Em：600-700 nm
[CHO细胞]
<检测条件>放大倍率：20倍； 激发波长：Ex：561 nm；发射波长：Em：600-700 nm
|
| Q5: 自噬有哪些途径？DAPRed可以检测到哪些状态？ |
| A5: 众所周知，自噬根据其分子机制可以分为两种：一种是依赖于ATG5的传统自噬(LC3发生变化），另一种则是非依赖于ATG的选择性自噬（LC3形式的转化并未发生）。 当形成自噬体膜时，DAPRed可以掺入其中，并在脂溶性环境中产生荧光。因此DAPRed可以检测自噬体的状态。 *参考资料：发现新的自噬机制Shigeomi Shimizu https://www.dojindo.co.jp/letterj/160/review/01.html 文献链接：http://dx.doi.org/10.14348/molcells.2018.2215 ▶对于首次检测的细胞类型和实验条件，请参考FAQ[如何确定细胞自噬探针DAPRed的最佳浓度]。 |
参考文献
| No. |
检测样品 |
检测仪器 |
引用(含链接) |
| 1) |
细胞 |
荧光显微镜 |
X. Chen, X. Yan, J. Liu and L. Zhang, " Chaiqi decoction ameliorates vascular endothelial injury in metabolic syndrome by upregulating autophagy.", Am. J. Transl. Res., 2020,12(9), 4902. |
| 2) |
细胞 |
荧光显微镜 |
H. Fang , S. Geng, M. Hao, Q. Chen, M. Liu, C. Liu, Z. Tian, C. Wang, T. Takebe, J-L Guan, Y. Chen, Z. Guo, W. He and J. Diao, "Simultaneous Zn2+ tracking in multiple organelles using super-resolution morphology-correlated organelle identification in living cells ", Nat Commun, 2021, 12(1), 109. 10.1016/j.envpol.2019.07.105. |
| 3) |
细胞 |
荧光显微镜 |
H. Sun, R. Wang, Y. Liu, H. Mei and X. Liu , "USP11 induce resistance to 5-Fluorouracil in Colorectal Cancer through activating autophagy by stabilizing VCP", J Cancer , 2021, 12(8), 2317. |
| 4) |
细胞 |
荧光显微镜 |
M. Yagi, T. Toshima, R. Amamoto, Y. Do, H. Hirai, D. Setoyama, D. Kang and T. Uchiumi, "Mitochondrial translation deficiency impairs NAD+-mediated lysosomal acidification", EMBO J, 2021, doi:10.15252/embj.2020105268. |
LysoPrime Green - High Specificity and pH Resistance 货号：L261
溶酶体染色试剂Green
LysoPrime Green - High Specificity and pH Resistance
商品信息
储存条件：封入氮气后-80度保存
运输条件：常温
特点：
● 溶酶体特异性高
● 不易受溶酶体pH值变化的影响
● 染色后过夜仍可观察到荧光
规格性状
<可检测样品数>
每10 μl大约可检测10块35 mm dish或10块 μ-Slide 8 well Chamber Slides。
<保存上的注意事项>
● 长时间保存时，最理想的状态是封入氮气后-80℃保存。
● 本产品在冷冻(-20 ℃)条件下保存也会随时间缓慢变质。
如果没有-80℃的保存条件，建议尽早使用。
● 反复冻融易引发变质，应极力避免。
产品概述
溶酶体是常见的细胞器之一，由生物膜包裹多种分解酶组成的酸性胞内囊泡。溶酶体可以将细胞内的废物进行分解以维持细胞内各种状态的平衡。溶酶体的功能紊乱会造成或加剧包括神经退行性疾病在内的多种疾患，因此研究溶酶体对相关疾病机理的阐释及相应治疗药物的开发非常重要。
荧光探针活体染色是在研究溶酶体功能时最常用的手段，然而市面上的溶酶体荧光探针一般都存在特异性差和荧光强度随pH变化的问题。同仁化学研究所开发的LysoPrime Green荧光探针对溶酶体具有高度特异性，并且不易受pH值变化的影响，因此可以更准确的对溶酶体进行研究。另外，由于其细胞内的滞留能力强，还适用于需要长期荧光观察的实验。
溶酶体特异性高
使用LysoPrime Green(本产品)与市面上其他的溶酶体染料进行对比，并用溶酶体标记蛋白LAMP1-RFP表达的HeLa细胞进行验证。结果发现，其他产品在溶酶体以外的部位也有荧光，导致背景高。而LysoPrime Green的荧光背景受到有效控制(荧光图像Merged)。另外，在荧光图像的范围内检测荧光强度发现，LysoPrime Green比其他试剂的溶酶体染色部位的重合度更高。
不易受溶酶体pH变化
LysoPrime Green(本产品)与市面上的其他产品都是在溶酶体集聚的荧光染料。然而随着溶酶体酸性抑制剂的Bafilomycin A1的作用，溶酶体pH由酸性向中性变化的过程中，其他产品逐渐离开溶酶体，荧光信号也显著下降。而LysoPrime Green却可以继续保持在溶酶体内，荧光强度几乎不变，与其他产品的荧光减弱形成鲜明的对比。
溶酶体内的停留性高
LysoPrime Green(本产品)与市面上的其他产品在相同实验条件下进行对比，其他产品在染色90分钟后，荧光强度有明显的下降，而LysoPrime Green由于在溶酶体内的停留性能高，仍然可以维持高荧光强度。
此外，LysoPrime Green和其他产品染色HeLa细胞后，上流式细胞仪检测的结果发现，与“先胰酶消化再染色”的结果相比，其他产品的“先染色再胰酶消化”的结果的荧光强度有明显下降，而LysoPrime Green的胰酶处理前后的染色结果相差很小，说明LysoPrime Green的停留性能更强。
<检测条件>
Filter: FITC (Ex = 488 nm, Em = 515-545 nm)
实验例
用LysoPrime Green与LysoTrakcerTM Red同时对HeLa细胞染色后，用溶酶体抑制剂Bafilomycin A1处理后进行荧光观察。LysoPrime Green的荧光强度不受Bafilomycin A1作用的影响，而LysoTrackerTM Red的荧光强度伴随着BafilomycinA1的作用而不断降低。同时使用这两种试剂一起染色，使得溶酶体位置与pH变化的同时检测成为可能。另外，通过荧光酶标仪检测的话，还可以得到数值化的检测结果。
检测例1
将外泌体染料ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Deep Red(货号:EX03)染色后的外泌体加至LysoPrime Green染色的HeLa细胞。随着时间的推进，LysoPrime Green的荧光强度维持不变，而ExoSparkler Deep Red的荧光强度随时间不断增强(左图)。另外，通过添加可以抑制内体向溶酶体转变的抑制剂Bafilomycin A1，与未经抑制剂处理的Control组相比，Bafilomycin A1抑制组的细胞中没有ExoSparkler Deep Red的荧光，说明Bafilomycin A1的添加有效抑制了内体的成熟(右图)。
检测例2
用细胞自噬检测试剂DAPRed-Autophagy Detection(货号：D677)与LysoPrime Green或其他公司产品共染色HeLa细胞，经氨基酸饥饿处理后检测荧光。由于其他公司产品的荧光强度弱，无法长时间的对溶酶体荧光观察，而LysoPrime Green的荧光强度更高并且可以长时间染色，因此，与DAPRed的共染色结果，可以更准确的检测细胞自噬。
检测例3
用线粒体自噬检测试剂盒Mitophagy Detection Kit(货号：MD01)与LysoPrime Green或其他公司产品共染色SHSY-5Y细胞，经线粒体自噬诱导后检测荧光。由于其他公司产品的荧光强度弱，无法长时间的对溶酶体荧光观察，而LysoPrime Green的荧光强度更高并且可以长时间染色，因此，与Mtphagy Dye的共染色结果，可以更准确的检测线粒体自噬。
FAQ
| Q：运输温度和保存温度(-80℃)不同是否会对产品性能有影响？ |
| A：本品虽然是常温运输，但是在运输过程中并不会产生对产品性能有影响的变质。请您收到产品后立即-80℃保存。同仁化学研究所经检测确认在常温(25℃)下保存一个月，并不会对产品的性能有影响。 |
| Q：染色后似乎有溶酶体以外的部位也被染色的情况出现？ |
| A：有可能是LysoPrime Green与细胞核或其他细胞器的非特异性吸附造成的。LysoPrime Green的最佳染色浓度与细胞种类及细胞密度有关，在配制Working solution的时候建议在1,000倍-4,000倍稀释的范围内进行摸索。作为参考，下图是染色HeLa细胞时，分别用1,000倍、2,000倍、4,000倍稀释后的染色结果，其中1,000倍稀释时的结果有观察到非特异性吸附。 |
| Q：可以用含血清的培养基染色吗？ |
| A：不可以，LysoPrime Green会受血清的影响，请务必使用HBSS或无血清培养基等不含血清的溶液配制working solution。 |
| Q：实验需要用对溶酶体pH值有影响的药物进行刺激，此时先刺激再染色还是先染色再刺激比较合适？ |
| A：推荐先染色再刺激。LysoPrime Green是根据pH值集聚在溶酶体的，在溶酶体处聚集后，即使pH值再变化也会继续停留在溶酶体处。如果先用药物刺激导致溶酶体pH呈中性，会导致LysoPrime Green无法在溶酶体处聚集，因此建议先染色再刺激。 |
| Q：是否可以用一般的荧光显微镜观察？ |
| A：可以用一般的荧光显微镜观察，但是有个别细胞系可能无法观察。此时建议使用激光共聚焦显微镜。 |
产品文献
1、Mei C. Q. Houser, Shane P. C. Mitchell, Priyanka Sinha , Brianna Lundin, Oksana Berezovska and Masato Maesako ，”Endosome and Lysosome Membrane Properties Functionally Link to γ-Secretase in Live/Intact Cells”，2023，Sensors【1.9】doi：10.3390/s23052651
2、Syu-ichi Kanno, Akiyoshi Hara Everolimus prevents doxorubicin-induced apoptosis in H9c2 cardiomyocytes but not in MCF-7 cancer cells: Cardioprotective roles of autophagy, mitophagy, and AKT 2023，Toxicology in Vitro，【IF：3.2】doi.org/10.1016/j.tiv.2023.105698
3、Mayuko Yagi , Minami Hama , Sayaka Ichii , Yurie Nakashima , Daiki Kanbayashi ， Takako Kurata , Kosuke Yusa , Jun Komano S phingomyelin synthase 1 supports two steps of rubella virus life cycle 2023，iscience，【IF：5.8】doi: 10.1016/j.isci.2023.108267
LysoPrime Deep Red - High Specificity and pH Resistance 货号：L264
溶酶体染色试剂Deep Red
LysoPrime Deep Red - High Specificity and pH Resistance
商品信息
储存条件：-20℃避光保存
运输条件：常温
特点：
● 溶酶体特异性高
● 不易受溶酶体pH值变化的影响
● 染色后过夜仍可观察到荧光
产品概述
溶酶体是常见的细胞器之一，由生物膜包裹多种分解酶组成的酸性胞内囊泡。溶酶体可以将细胞内的废物进行分解以维持细胞内各种状态的平衡。溶酶体的功能紊乱会造成或加剧包括神经退行性疾病在内的多种疾患，因此研究溶酶体对相关疾病机理的阐释及相应治疗药物的开发非常重要。
荧光探针活体染色是在研究溶酶体功能时最常用的手段，然而市面上的溶酶体荧光探针一般都存在特异性差和荧光强度随pH变化的问题。同仁化学研究所开发的LysoPrime Deep Red荧光探针对溶酶体具有高度特异性，并且不易受pH值变化的影响，因此可以更准确的对溶酶体进行研究。另外，由于其细胞内的滞留能力强，还适用于需要长期荧光观察的实验。
溶酶体特异性高
分别使用传统溶酶体荧光探针与LysoPrime Deep Red在溶酶体特异性标记物LAMP1-GFP表达的HeLa细胞中进行对比。结果可以看出，传统溶酶体荧光探针在溶酶体以外的地方也有荧光，造成背景荧光高的问题。而LysoPrime Deep Red可以有效抑制背景荧光(Merged荧光图像)，展现出更高的溶酶体特异性。
<检测条件>
Green: Ex= 488 nm, Em= 500-570 nm
Deep Red : Ex= 633 nm, Em= 640-700 nm
不易受溶酶体pH变化影响
LysoPrime Deep Red与市面上的其他产品都是在溶酶体集聚的荧光染料。然而随着溶酶体酸性抑制剂Bafilomycin A1的作用，溶酶体pH由酸性向中性变化的过程中，其他产品逐渐离开溶酶体，荧光信号也显著下降。而LysoPrime Deep Red却可以继续保持在溶酶体内，荧光强度几乎不变，与其他产品的荧光减弱形成鲜明的对比。
＜检测条件＞
Deep Red: Ex= 633 nm, Em= 640-700 nm
Red: Ex= 561 nm, Em= 560-620 nm
溶酶体内的停留性高
LysoPrime Deep Red与市面上的其他产品在相同实验条件下进行对比，其他产品在染色24小时后，荧光强度有明显的下降，而LysoPrime Deep Red由于在溶酶体内的停留性能高，仍然可以维持高荧光强度。
<检测条件>
Deep Red: Ex= 633 nm, Em= 640-700 nm
Green: Ex= 488 nm, Em= 490-550 nm
Red: Ex= 561 nm, Em= 560-620 nm
实验例
细胞衰老所引起的溶酶体量和pH的变化
用Doxorubicin(DOX)刺激A549细胞诱导细胞衰老后，检测细胞内衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)和溶酶体量与pH的变化。用细胞衰老检测试剂盒—Cellular Senescence Detection Kit - SPiDER-βGal(货号：SG03)检测细胞衰老，分别用LysoPrime Deep Red和pHLys Red(货号：L265)检测溶酶体的量和pH的变化。荧光显微镜的观察结果发现伴随着细胞衰老的发生，三个检测指标均有上升。另外，通过酶标仪的数值化的检测，也得到了相同的检测结果。
<检测条件>
SA-βGal(绿):
Ex = 488 nm, Em = 490 – 550 nm
溶酶体pH (红):
Ex = 561 nm, Em = 560 – 620 nm
溶酶体的量(紫):
Ex = 633 nm, Em = 640 – 700 nm
<检测条件>
SA-βGal: Ex = 525 – 535 nm, Em = 550 – 570 nm
溶酶体pH: Ex = 555 – 565 nm, Em = 590 – 610 nm
溶酶体的量: Ex = 645 – 655 nm, Em = 690 – 710 nm
FAQ
| Q：是否可以用含有血清的培养基进行染色？ |
| A：由于血清会对LysoPrime Deep Red产生影响，因此不能用含有血清的培养基染色。另外，除了无血清培养基以外，还可以用HBSS溶液配制working solution。 |
| Q：实验中需要加入对溶酶体pH有影响的药物。加入药物的时机需要在LysoPrime Deep Red染色之前还是之后？ |
| A：请在LysoPrime Deep Red染色之后再进行药物刺激。LysoPrime Deep Red在溶酶体处积蓄后，即使溶酶体的pH发生变化，仍可停留在溶酶体处。但是，如果先进行药物刺激，溶酶体的pH接近中性的话， LysoPrime Deep Red将无法在溶媒体处聚集。因此，请先进行LysoPrime Deep Red的染色，再进行药物刺激 |
| Q：我想同时检测溶酶体的量和pH，是否可以与pHLys Red共染色？
|
| A：可以。但是请先染色LysoPrime Deep Red再染色pHLys Red |
| Q：可以检测的仪器和对应的滤光片有哪些？ |
| A： ・激光共聚焦显微镜 Ex = 633 nm, Em= 640-700 nm
・普通荧光显微镜 Cy5 Filter Ex = 590 - 650 nm, Em= 660 - 740 nm
・荧光酶标仪 Ex = 645 – 655 nm, Em= 690 – 710 nm |
| Q: 在摸索最佳染色条件时，LysoPrime Deep Red的浓度为多少比较合适？ |
| A：推荐1000倍稀释LysoPrime Deep Red。如果需要摸索最佳实验条件，请参考下列范围。 <如果发现荧光背景高> 请在2000-5000倍稀释范围内进行摸索。 |
pHLys Red - Lysosomal Acidic pH Detection 货号：L265
溶酶体pH检测试剂Red
pHLys Red - Lysosomal Acidic pH Detection
商品信息
储存条件：冷暗处保存
运输条件：常温
特点：
● 溶酶体特异性高
● 高灵敏度检测溶酶体pH
● 染色后过夜仍可观察到荧光
产品概述
溶酶体是常见的细胞器之一，由生物膜包裹多种分解酶组成的酸性胞内囊泡。溶酶体可以将细胞内的废物进行分解以维持细胞内各种状态的平衡。溶酶体的功能紊乱会造成或加剧包括神经退行性疾病在内的多种疾患，因此研究溶酶体对相关疾病机理的阐释及相应治疗药物的开发非常重要。
荧光探针活体染色是在研究溶酶体功能时最常用的手段，然而市面上的溶酶体荧光探针一般都存在特异性差和荧光强度随pH变化的问题。同仁化学研究所开发的pHLys Red对溶酶体的特异性高并且可以灵敏的检测溶酶体的pH变化，得到更准确的检测结果。此外，由于停留性能好，该荧光探针还可用于需要长时间观察的实验。
高灵敏度检测溶酶体pH
现有的溶酶体pH检测试剂在准确的溶酶体定位和灵敏度方面存在一定的问题。 用低浓度溶酶体酸度抑制剂Bafilomycin A1（Baf. A1）处理的HeLa细胞用pHLys Red或现有的染料染色，并进行荧光成像。 结果显示，与现有的染料相比，pHLys Red对溶酶体pH值的变化更敏感。
<检测条件>
pHLys Red:Ex = 561 nm, Em = 560 - 620 nm
Sensor Y/B:Ex = 561 nm, Em = 560 - 620 nm
Sensor G:Ex = 488 nm, Em = 490 - 550 nm
另外，在试管内检测各pH值下，pHLys Red的荧光强度变化。结果显示，pHLys Red在pH4.0-5.5的范围内，荧光强度变化最显著。
溶酶体特异性高
分别使用传统溶酶体荧光探针与pHLys Red在溶酶体特异性标记物LAMP1-GFP表达的HeLa细胞中进行对比。结果可以看出，传统溶酶体荧光探针在溶酶体以外的地方也有荧光，造成背景荧光高的问题。而pHLys Red可以有效抑制背景荧光(Merged荧光图像)，展现出更高的溶酶体特异性。
<检测条件>
Green: Ex= 488 nm, Em= 500-570 nm
Red : Ex= 561 nm, Em= 560-620 nm
溶酶体内的停留性高
pHLys Red与市面上的其他产品在相同实验条件下进行对比，其他产品在染色24小时后，荧光强度有明显的下降，而pHLys Red由于在溶酶体内的停留性能高，仍然可以维持高荧光强度。
<检测条件>
Green: Ex= 488 nm, Em= 490-550 nm
Red: Ex= 561 nm, Em= 560-620 nm
实验例
细胞衰老所引起的溶酶体量和pH的变化
用Doxorubicin(DOX)刺激A549细胞诱导细胞衰老后，检测细胞内衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)和溶酶体量与pH的变化。用细胞衰老检测试剂盒—Cellular Senescence Detection Kit - SPiDER-βGal(货号：SG03)检测细胞衰老，分别用pHLys Red和LysoPrime Deep Red(货号：L264)检测溶酶体的量和pH的变化。荧光显微镜的观察结果发现伴随着细胞衰老的发生，三个检测指标均有上升。另外，通过酶标仪的数值化的检测，也得到了相同的检测结果。
<检测条件>
SA-βGal(绿) : Ex = 488 nm, Em = 490 – 550 nm
溶酶体pH (红) : Ex = 561 nm, Em = 560 – 620 nm
溶酶体的量(紫) : Ex = 633 nm, Em = 640 – 700 nm
<检测条件>
SA-βGal: Ex = 525 – 535 nm, Em = 550 – 570 nm
溶酶体pH: Ex = 555 – 565 nm, Em = 590 – 610 nm
溶酶体的量: Ex = 645 – 655 nm, Em = 690 – 710 nm
FAQ
| Q：是否可以培养基以外的溶液配制working solution
|
| A：可以。还可以使用HBSS或PBS配制working solution。 |
| Q：实验中需要加入对溶酶体pH有影响的药物。加入药物的时机需要在pHLys Red染色之前还是之后？ |
| A：请在pHLys Red染色之后再进行药物刺激。由于pHLys Red可以在正常状态的溶酶体处聚集，如果先进行药物刺激导致溶酶体的pH升高到中性附近的话，pHLys Red将无法在溶酶体处聚集。因此请先染色再进行药物刺激。
如果使用Bafilomycin A1进行刺激的话，可以将pHLys Red working solution与Bafilomycin A1一起同时加入，或者也可以先进行pHLys Red染色，再加入Bafilomycin A1。 |
| Q：我想同时检测溶酶体的量和pH，是否可以与LysoPrime系列共染色？ |
| A：可以。但是请先染色LysoPrime再染色pHLys Red。 |
| Q：可以检测的仪器和对应的滤光片有哪些？
|
| A： ・激光共聚焦显微镜 Ex = 561 nm, Em= 560-620 nm
・普通荧光显微镜 TxRed Filter Ex = 540 - 580 nm, Em: 590 - 670 nm
・荧光酶标仪 Ex = 555 – 565 nm, Em = 590 – 610 nm |
| Q: 在摸索最佳染色条件时，pHLys Red的浓度为多少比较合适？ |
| A：推荐1000倍稀释pHLys Red。如果需要摸索最佳实验条件，请参考下列范围。 <如果发现荧光较弱> 请在250-500倍稀释范围内进行摸索。 |
Lysosomal Acidic pH Detection Kit 货号：L266
溶酶体pH检测试剂盒
Lysosomal Acidic pH Detection Kit
商品信息
储存条件：-80度保存
运输条件：常温
特点：
● 溶酶体特异性高
● 灵敏的检测溶酶体pH
● 试剂盒中包含溶酶体酸性化抑制剂
产品概述
溶酶体是常见的细胞器之一，由生物膜包裹多种分解酶组成的酸性胞内囊泡。溶酶体可以将细胞内的废物进行分解以维持细胞内各种状态的平衡。溶酶体的功能紊乱会造成或加剧包括神经退行性疾病在内的多种疾患，因此研究溶酶体对相关疾病机理的阐释及相应治疗药物的开发非常重要。
荧光探针活体染色是在研究溶酶体功能时最常用的手段，然而市面上的溶酶体荧光探针一般都存在特异性差和荧光强度随pH变化的问题。同仁化学研究所开发的试剂盒对溶酶体的特异性高并且可以灵敏的检测溶酶体的pH变化，得到更准确的检测结果。此外，由于停留性能好，该荧光探针还可用于需要长时间观察的实验。
检测溶酶体机能
本试剂盒包含两种不同的溶酶体荧光探针：荧光强度随pH变化的pHLys Red和荧光强度不随pH变化的LysoPrime Green。通过组合使用这两种染料可以同时对溶酶体的量和pH变化进行检测，全面的了解溶酶体状态。另外，试剂盒中还包含溶酶体酸性化抑制剂Bafilomycin A1，即使是第一次做相关实验的科研人员也可以轻松上手。
本试剂盒可检测的溶酶体机能指标
荧光强度随pH变化的荧光探针pHLys Red
荧光强度不随pH变化的荧光探针LysoPrime Green
试剂盒内含溶酶体酸性化抑制剂
用溶酶体酸性化抑制剂Bafilomycin A1(Baf. A1)诱导HeLa细胞后，用本试剂盒同时检测溶酶体的量和pH变化。结果显示，与对照组相比，加药组中溶酶体的pH降低，而溶酶体的量基本没有变化。
<检测条件>
LysoPrime Green (绿):
Ex = 488 nm, Em = 490 – 550 nm
pHLys Red (红):
Ex = 561 nm, Em = 560 – 620 nm
FAQ
| Q：运输温度和长期保存温度(-80℃)存在差异，是否会有问题？ |
| A：本品虽然是常温运输，运输期间的保存温度经过测试不会对产品性能产生影响。您在收到试剂后请在-80℃下保存。
另外，本试剂需要-80℃保存的试剂是LysoPrime Green，有关不同温度下(25℃、4 ℃、 -20 ℃、 -80℃)长期保存对染色效果的影响，请参照同仁化学研究所的产品网页(货号： L261)的FAQ部分。经过测试，在室温(25℃)保存一个月不会对产品性能产生影响。 |
| Q：实验中需要加入对溶酶体pH有影响的药物。有哪些需要注意的地方？ |
| A：请先进行LysoPrime Green染色，再进行药物刺激。而pHLys Red的染色也请在LysoPrime Green染色后再进行。 如果使用试剂盒附带的Bafilomycin A1进行刺激的话，可以将pHLys Red working solution与Bafilomycin A1一起同时加入，或者也可以先进行pHLys Red染色，再加入Bafilomycin A1。 |
| Q：是否可以用含血清的培养基进行染色？ |
| A：由于LysoPrime Green会受到血清的影响，所以请使用不含血清的培养基或者HBSS配制working solution。
pHLys Red可以用含血清的培养基或者HBSS、PBS溶液来配制working solution。 |
| Q:是否可以用一般的的荧光显微镜观察？ |
| A：可以用一般的荧光显微镜观察，但是有个别细胞系可能无法观察。此时建议使用激光共聚焦显微镜。 |
Lysosomal Acidic pH Detection Kit-Green/Deep Red 货号：L268
溶酶体染色试剂
Lysosomal Acidic pH Detection Kit-Green/Deep Red
商品信息
储存条件：-20°C 冷冻、避光 。氯仿替换，吸潮
运输条件：常温
特点：
● 可对同一样品准确检测溶酶体pH变化情况及溶酶体量的变化
● 通过荧光显微镜和FCM检测，可进行荧光成像和定量分析
规格性状
<使用次数>
本试剂盒使用不同板材检测次数如下：
（35 mm dish） 10 枚、（μ-Slide 8 well） 10 枚、（96-well Plate） 2 枚
产品概述
溶酶体是细胞内的细胞器，是一种酸性囊泡，通过降解不需要的物质，为维持体内的平衡作出贡献。 由于溶酶体功能障碍与神经退行性疾病和其他疾病的发生和发展都息息相关，对溶酶体的详细研究在阐明病理条件和开发治疗药物方面引起了关注。 此外，最近的研究表明，在神经退行性疾病阿尔茨海默病的小鼠模型中，溶酶体内部的酸度降低，阻碍了自噬体内部废物的降解，导致有毒的淀粉样蛋白-β的积累*，增加了确认溶酶体pH值的必要性，检测溶酶体的pH值的需求正在增加。
使用小分子荧光染料的活体成像已被广泛用于分析溶酶体活细胞，但染料的特异性和对pH值变化反应的荧光亮度的准确性仍然被列为挑战。 该产品内含两种荧光染料，克服了这些问题，结合起来就能进行更准确地进行溶酶体活细胞分析。
*Nature Neuroscience, 2022, 25, 688–701.
性能简介
「pH 值和溶酶体量」2种变化量
现有的试剂，因为只能评判单一的荧光强弱，很难判别溶酶体的数量或功能(pH)的变化。而本试剂盒包含pHLys Green和LysoPrime Deep Red【货号：L264】，前者对溶酶体具有高度特异性，并显示出随pH值变化的荧光波动，后者则具有非pH依赖性的特性 。将这两种染料组合，即可用同一样品测定溶酶体的pH和量，可以对溶酶体功能进行详细分析。
为什么能准确分析溶酶体功能？
pHLys Green和现有产品的比较
目前已有的溶酶体pH检测试剂在染料定位、pH敏感性和滞留型方面存在问题。 本试剂盒内改进了染料滞留型，并且能准确定位检测到正常的溶酶体，且改进后，其pH灵敏度能够检测到轻微的pH变化
*点击查看LysoPrime Deep Red与现有产品的比较。
产品特点
测量所需的试剂都包含在本试剂盒中。 染料的荧光特性也允许与具有红色荧光特性的染料共同染色。
与现有试剂盒比较
与市面上现有的染料相比，同仁化学的溶酶体检测试剂系列，可以选择性地聚集在溶酶体上并持续染色24小时以上。通过联合运用，可以更准确地确认溶酶体的量和pH值。
| 【本产品】 Lysosomal Acidic pH Detection Kit -Green/Deep Red（L268） |
其他公司 | 其他公司 | ||||
| 荧光颜色 / 波长 |
pHLys Green
Ex=488 nm Em=490-550 nm |
Ex=633 nm Em=640-700 nm |
Ex=561 nm Em=560-650 nm |
Ex=488 nm Em=500-600 nm |
溶酶体pH染料 |
溶酶体染料 |
| 用途 | pH | 量 | pH | 量 | pH | 量 |
| 溶酶体pH 依赖性 |
〇 | X |
〇 | X | △ | △ |
| 溶酶体 特异性 |
〇 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 |
| 溶酶体 滞留性 |
〇 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 |
| 检测仪器 |
荧光显微镜•FCM |
荧光显微镜•共聚焦 |
荧光显微镜 | 荧光显微镜 | ||
实验例
使用Bafilomycin A1观察溶酶体pH变化的成像以及FCM分析
使用HeLa细胞，检测溶酶体酸性抑制剂Bafilomycin A1 (Baf. A1)处理时的溶酶体的量和pH变化。LysoPrime Deep Red的荧光几乎不受添加Baf. A1的影响，而pHLys Green则是Baf. A1随着添加的溶酶体中性化确认了荧光的降低。另外，通过上流式也可以检测出来。由此可见，添加Baf. A1虽然会降低溶酶体功能，但对溶酶体的量没有影响。
检测条件
pHLys Green（緑）：Ex = 488 nm, Em = 490 - 550 nm
LysoPrime Deep Red（紫）：Ex = 633 nm, Em = 640 - 700 nm
检测条件
pHLys Green (FITC Filter)：Ex=488 nm,Em=515-545 nm
LysoPrime Deep Red (APC Filter)：Ex=640 nm,Em=650-670 nm
测量细胞内铁的变化和溶酶体的pH值变化
溶酶体功能和铁之间的关系在神经退行性疾病中很有意义，据报道，溶酶体中和会导致细胞内铁的减少，这是由于铁储存（转铁蛋白或铁蛋白）未能降解。*
分别准备在SH-SY5Y细胞中添加溶酶体酸化抑制剂（Bafilomycin A1）和添加铁螯合剂（Deferipron (DFP)）的实验组，检测在同一样品中溶酶体pH值和细胞内铁的变化情况。 (溶酶体pH值检测：本试剂盒，细胞内铁：FerroOrange[货号：F374]）。结果显示，加入Bafilomycin A1后，FerroOrange的荧光减少，证实了细胞内铁的减少。；LysoPrime DeepRed的荧光几乎没有变化，而pHLys Green的荧光由于溶酶体的中和作用而下降。 这些结果表明，在细胞内铁的变化和溶酶体功能之间存在着联系。
*Mol Cell., 2020, 77(3), 645-655.
＜检测条件＞
pHLys Green（緑）： Ex=488 nm, Em=486-574 nm
FerroOrange（赤）： Ex=561 nm, Em=550-650 nm
LysoPrime Deep Red（紫）： Ex=633 nm, Em=599-700 nm
溶酶体染色试剂一览
| 检测对象：溶酶体（荧光颜色） | 产品名称 | 检测仪器 | 荧光特性 | 规格及使用次数 | ||||
| 荧光显微镜 | FCM | 荧光酶标仪 | ||||||
| pH | 量 | Lysosomal Acidic pH Detection Kit-Green/Deep Red (L268) | 〇 | 〇 | × | (绿) pHLys Green (紫) LysoPrime Deep Red |
1 set | 35 mm dish 10 枚 μ-Slide 8 well 10 枚 96-well Plate 2 枚 |
| pH | 量 | Lysosomal Acidic pH Detection Kit (L266) | 〇 | × | 〇 | (红) pHLys Red (绿) LysoPrime Green |
1 set | |
| pH | pHLys Red- Lysosomal Acidic pH Detection (L265) | 〇 | × | 〇 | (红) pHLys Red ：Ex. 561/Em. 560-650 |
1 tube 3 tubes |
每1 tube、 35 mm dish 10 枚、 μ-Slide 8 well 10 枚、 96-well Plate 2 枚 |
|
| 量 | LysoPrime Deep Red - High Specificity and pH Resistance (L264) | 〇 | 〇 | 〇 | (紫) LysoPrime Deep Red ：Ex. 633/Em. 640-700 |
1 tube 3 tubes |
||
| 量 | LysoPrime Green- High Specificity and pH Resistance (L261) | 〇 | × | 〇 | (绿) LysoPrime Green ：Ex. 488/Em. 500-600 |
10μl x 1 10μl x 3 |
每10 μl 、 35 mm dish 10 枚、 μ-Slide 8 well 10 枚 96-well Plate 2 枚 |
|
常见问题Q&A
| Q1：检测药物刺激与溶酶体pH影响实验时，需要有哪些实验注意要点？ |
| A1：LysoPrime Deep Red的染色应始终在药物刺激前进行。另外pHLys Green的染色必须在LysoPrime Deep Red染色后进行。在使用本试剂盒内含的Bafilomycin A1（溶酶体酸化抑制剂）进行刺激时，可以把Bafilomycin A1加入pHLys Green的工作液中，同时进行染色和刺激，或者先对pHLys Green染色，后添加Bafilomycin A1刺激。 |
| Q2：是否可使用含血清的培养基染色？ |
| A2：LysoPrime Deep Red会受血清影响，因此不能使用含血清的培养基进行染色。请确保使用无血清的培养基或HBSS来制备工作液。pHLys Green可使用含血清的培养基，除培养基外，也可以使用HBSS、PBS。 |
| Q3：考虑染色条件时，应使用什么浓度的LysoPrime Deep Red和pHLys Green？ |
| A3：为了优化染色条件，请参考以下内容：
● LysoPrime Deep Red <当荧光强度较弱时> 使用500-1000倍稀释倍数进行尝试
<当发现有非特异性染色时> 使用1000-1500倍稀释倍数进行尝试 ● pHLys Green <当荧光强度较弱时> 使用250-1000倍稀释倍数进行尝试 <当发现有非特异性染色时> 使用1000-2000倍稀释倍数进行尝试 |
细胞衰老检测试剂盒—Cellular Senescence Detection Kit - SPiDER-βGal 货号：SG03
细胞衰老检测试剂盒SPiDERβGal
Cellular Senescence Detection Kit - SPiDER-βGal
商品信息
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温
特点：
● 活细胞和固定细胞均可染色
● 可用共聚焦显微镜或流式细胞仪检测
● 可固定后与抗体共染色
试剂盒内含
产品概述
正常细胞的DNA损伤是由细胞的不断分裂和氧化应激引起。在没有修复DNA损伤的情况下，为了抑制细胞的癌化，需要不可逆地终止DNA损伤细胞的分裂。细胞衰老是一种可以不可逆地终止DNA损伤细胞分裂的状态，它可以抑制DNA受损细胞的生长。SA-β-gal (细胞衰老β-半乳糖苷酶)在衰老细胞中过表达，被广泛作为细胞衰老的标识之一。用X-gal染色检测SA-β-gal是一种常用的方法，但此方法存在几个缺点：
1)由于细胞透膜性差，需要固定细胞。
2)由于很难区分染色细胞和未染色细胞，所以定量困难。
3)染色时间长。
本试剂盒检测SA-β-gal灵敏度高，方法简便。SPiDER-βGal是一种检测β-gal的新型试剂，具有细胞透膜性高，胞内荧光维持时间长的特点。本试剂盒不仅可以特异性地检测到活细胞中的SA-β-gal(用Bafilomycin A1抑制内源性β-galactosidase的活性)，也可以检测到固定细胞中的SA-β-gal(用McIlvaine缓冲液 (pH 6.0)。由于SPiDER-βGal和SA-β-gal反应后会产生很强且持续的荧光，因此SPiDER-βGal可被用于流式细胞仪来进行定量分析。
原理
由于该试剂盒中的β-半乳糖苷酶检测试剂SPiDER-βGal具有细胞膜通透性，因此无需特别的细胞膜通透性处理或固定细胞，即可直接检测活细胞。穿透细胞膜的SPiDER-βGal通过与SA-β-gal反应发出荧光，并会与附近的蛋白质共价结合。另外，通过在加SPiDER-βGal之前，添加试剂盒内含的Bafilomycin A1，可抑制活细胞中内源性β-半乳糖苷酶的活性，并且抑制背景的状态下检测到SA-β-gal的荧光。
荧光特性
SPiDER-βGal和β-半乳糖苷酶反应的激发和发射光谱图
<推荐波长>
Ex：500~540 nm
Em：530~570 nm
用共聚焦显微镜或流式细胞仪（请选择488 nm激发波长）
操作步骤
产品优势
特点1：适用于活细胞和固定细胞
检测固定化细胞时，不需要添加Bafilomycin A1，按照说明书记载的操作流程检测SA-βgal。
*活细胞添加Bafilomycin A1的原因：请参阅常见问题“为什么添加Bafilomycin A1？”。
特点2：可定量检测
细胞衰老与细胞周期
细胞衰老与细胞周期之间的关系
阿霉素（DOX）会作用于细胞周期的G2/M期，抑制细胞增殖，并诱导细胞衰老。将DOX加入A549细胞后，G2/M期的峰值升高 (Cell Cycle Assay Solution Blue and Deep Red)衰老指标SA-β-gal增强（细胞衰老检测试剂盒-SPiDER-βGal）以及细胞线粒体膜电位降低(JC-1 MitoMP Detection Kit)。
实验例
与其他细胞衰老标记物的共染色
本实验是使用本试剂盒对细胞衰老的常用模型多次传代的Wl38细胞 (Passage 的 SA-βgal 进行检测的实例a）。与其他的细胞衰老标记物γH2AX DNA损伤标记物）的免疫染色b），以及全细胞的核染色（DAPI）c）。SA-βgal和γH2AX两种细胞衰老标记物的实验结果相关性得到了验证。d）
1）将传代1次和10次的Wl 38细胞按照本试剂盒的说明书的“活细胞检测”步骤进行SA-βgal染色。
2）添加4% PFA/PBS，室温培养15 min。
3）PBS清洗细胞3次。
4）加入0.1% Triton X 100/PBS，室温培养30 min。
5）PBS清洗细胞3次。
6）添加1% BSA/PBS，室温培养1 h。
7）用1% BSA/PBS稀释过的抗γH2AX抗体（兔源）加入至细胞后，过夜培养。
8）PBS清洗细胞3次。
9）用1% BSA/PBS稀释过的抗兔二抗（Alexa Fluor 647）加入至细胞后，室温培养2 h。
10）PBS清洗细胞3次。
11）用PBS稀释至 2μg/ ml 的 DAPI 溶液 同仁货号： D523]加入到细胞中，室温培养10 min 。
12）PBS 清洗细胞3 次，用激光共聚焦显微镜观察。
固定WI-38细胞中SA- β-gal与DNA损伤标记物共染
SPiDER-βGal工作液配制
用pH 6.0的McIlvaine 缓冲液稀释SPiDER-βGal DMSO储存液2,000倍。
*固定操作和细胞膜通透性可能会导致灵敏度降低（图1），如果您需要更高的信号，可以将McIlvaine buffer稀释SPiDER-βGal DMSO储存液的倍数调整为500-1000倍（图2）。
McIlvaine buffer（pH6.0）的制备
将3.7ml 0.1 mol/l的柠檬酸溶液和6.3ml 0.2 mol/l的磷酸钠溶液混合。确认pH为6.0，如pH不是6.0，则可通过添加柠檬酸溶液或磷酸钠溶液来调价pH。使用超纯水将该缓冲液稀释5倍。
染色步骤（35 mm 培养皿）
1. 在35 mm 培养皿中接种细胞后，在37℃，5％ CO2培养箱中过夜培养。
2. 去除培养基，用2 ml PBS洗涤1次后，加入2 ml 4％的多聚 甲醛(PFA)/PBS溶液，在室温固定3 min。
*避免延长培养时间，否则容易导致SA-β-gal活性降低
3. 去除上清液，用2 ml HBSS洗涤3次。
4. 加入2 ml SPiDER-βGal工作液后，在37℃培养30 min。
＊用固定细胞检测SA-β-gal时，请不要使用5％ CO2培养箱。如果使用5％ CO2培养箱，SPiDER-βGal工作液会变成酸性，与内源性β-galactosidase发生反应，背景会上升，很难区分正常细胞和衰老细胞。
5. 去除上清液，用2 ml PBS洗涤2次。
6.在细胞中加入0.1% Triton X-100/PBS，并在室温下培养30分钟。
7.用PBS洗涤细胞2次。
8.向细胞中加入1% BSA/PBS，并在室温中培养1小时。
9.向细胞中加入1% BSA/PBS稀释的抗γ-H2AX抗体（小鼠），并在4℃孵育过夜。
10.用PBS洗涤细胞3次。
11.向细胞中加入1％BSA/PBS稀释的抗小鼠二抗（Cy5），并在室温下孵育1小时。
12.用PBS洗涤细胞两次，并在荧光显微镜下观察。
SA-β-gal检测T细胞（悬浮细胞）
爱媛大学医学院Masakatsu Yamashita教授的研究小组表明，一种叫做menin的蛋白质可以控制T细胞的衰竭和衰老，并维持其正常的免疫功能。
这次通过使用的SPiDER-βGal染色结果确认，我们证实了在白细胞介素2（IL-2）的存在下，对敲除Menin蛋白的CD8阳性细胞通过刺激TCR（T细胞受体），会发生细胞衰老。
染色条件：
① SPiDER-βGal 方法
② X-gal 方法
*数据由爱媛大学医学系Masakatsu Yamashita教授提供
用共聚焦成像细胞仪进行定量用
用共聚焦成像细胞仪（横河电机株式会社CQ1 ）进行衰老细胞定量分析。
■与其他细胞衰老标记物共染色用
SPiDER-βGal 对 SA-β-gal 进行活细胞染色并进行细胞固定和膜透过处理后，对DNA损伤标志物γH2AX进行免疫荧光染色的 WI-38 细胞，通过共聚焦定量成像细胞仪进行定量和分析。
定量解析
散点图（Scatter Plot）
使用SPiDER-βGal对SA-β-gal 进行染色，其荧光强度作为 Y 轴，以 γ H2AX 的面积与每个细胞核的面积的比值作为 X 轴做成散点图的定量分析。
活细胞荧光染色的分析
X-gal法需要用目视观察总细胞数和衰老细胞的个数，并人工计算衰老细胞的阳性比率。
而使用共聚焦定量成像细胞仪时，用核染色剂（Hoechst 33342）来计数总细胞数 SPiDER-βGal对 SA-β-gal 进行染色来计算衰老细胞数，即可获得衰老细胞的阳性比率。
横河电机
CQ01 拍摄条件
使用孔板：96 孔板
物镜：10 倍
拍摄波长：405 nm Hoechst 33342 Cyan
488 nm （SPiDER-βGal Green）
视野：8视野
*SA-β-gal阳性Wl-38细胞（红色轮廓）
WI-38细胞中的SA-β-gal阳性细胞比例的差异取决于传代次数。与使用X-gal染色方法的手动计数操作相比，使用共聚焦可以快速分析数据。
SA-β-gal的荧光成像
1. 在35 mm μ-Dish（ibidi公司) 中分别接种传代数为0代和12代的Wl-38细胞 (5×10^4 个/dish、 10％ FBS、1％青霉素-链霉素的MEM培养基) 后，在37℃、5％ CO2培养箱中过夜培养。
2. 去除培养基，用2 ml HBSS洗涤1次。
3. 加入1 ml Bafilomycin A1工作液后，在37℃，5％ CO2培养箱中培养1 h。
4. 将1 ml SPiDER-βGal 工作液和1 μl浓度为1 mg/ml 的Hoechst 33342溶液混合后加入培养皿中，在37℃、5％ CO2培养箱中培养30 min。
5. 去除上清液，用2 ml HBSS洗涤2次.
6. 加入2 ml HBSS后，用共聚焦荧光显微镜观察(激发波长：488 nm，发射波长：500-600 nm)。
用流式细胞仪定量分析SA-β-gal阳性细胞
1. 在35 mm μ-Dish (ibidi公司) 中分别接种传代数为1代和12代的Wl-38细胞(1×105 个/dish，含有10％ FBS，1％青霉素-链霉素的MEM培养基)后，在37℃、5％ CO2培养箱中过夜培养。
2. 去除培养基，用2 ml HBSS洗涤1次。
3. 加入1 ml Bafilomycin A1工作液后，在37℃、5％ CO2培养箱中培养1 h。
4. 加入1 ml SPiDER-βGal工作液后，在37℃，5％ CO2培养箱中培养30 min。
5. 去除上清液，用2 ml HBSS洗涤2次。
6. 用胰蛋白酶消化细胞，将细胞用MEM培养基 (含有10%的FBS、1%的青霉素-链霉素)重悬。
7. 用流式细胞仪检测 (激发波长：488 nm，发射波长：515-545 nm)。
常见问题Q&A
| Q1: 本试剂盒的大概可以检测多少次？ |
| A1:大概的检测次数，请参考下表中不同的使用容器： |
| 35mm dish | Micro Plate | Chamber Slide | |
| 使用次数 | 5 dishes | 2 plates | 7 slides |
| *使用次数会随着每孔添加的染色溶液量的变化而变化。使用前请先确认每孔的必要的染色溶液量。 |
| Q2: 为什么要添加Bafilomycin A1？ |
| A2：很多细胞内部都存在内源性β-半乳糖苷酶 (β-galactosidase)，由于SPiDER-βGal与内源性β-半乳糖苷酶和细胞衰老的标记物SA-β-Gal都会发生反应。即使在没有衰老的细胞中，背景也较高，妨碍了SA-β-Gal的检测。 Bafilomycin A1可以抑制溶酶体中的ATPase活性，并将溶酶体中的pH从酸性变为接近中性，从而降低了内源性β-半乳糖苷酶的活性。因此，在添加SPiDER-βGal之前先用Bafilomycin A1处理细胞，使得SPiDER-βGal可以与SA-β-gal反应，并对衰老细胞进行荧光染色。 下图显示了添加和不添加Bafilomycin A1时检测SA-β-gal的差异。 由于Bafilomycin A1也被用作自噬的抑制剂。使用时，请考虑是否会对实验体系有影响，如果有影响，建议固定细胞。细胞固定时，缓冲液会控制细胞内的pH，所以不需要使用Bafilomycin A1。可以参照操作说明书中的步骤进行染色。
|
| Q3: DMSO stock solution 可以稳定保存多久？ |
| A3: SPiDER-βGal DMSO stock solution和Bafilomycin A1 DMSO stock solution配制后，-20℃可以稳定保存1个月。 |
| Q4: Working solution可以稳定保存多久？ |
| A4: SPiDER-βGal working solution和Bafilomycin A1 working solution无法长期保存，请现配现用。 |
| Q5: 做细胞衰老的荧光观察时有哪些注意事项？ |
| A5: 随着细胞的衰老，被称为脂褐素(Lipofuscin)的不溶性物质会在细胞中积聚。 脂褐素自身会产生荧光，进而增加荧光背景。 在这种情况下，我们建议您准备不含SPiDER-βGal的样品，以准确评估衰老细胞中的SA-β-gal活性。 流式细胞仪检测 ・测定“衰老细胞”和“正常细胞”的平均荧光强度（MFI） ①添加了SPiDER-βGal的细胞 ②未添加SPiDER-βGal的细胞 (背景) ・“①的平均荧光强度”减去“②的平均荧光强度” 用扣除背景后的SA-β-gal的荧光来表征SA-β-gal的活性。 a：SA-β-gal活性（衰老细胞）：＝①的平均荧光强度 - ②的平均荧光强度 b：SA-β-gal活性（正常细胞）：＝①的平均荧光强度 - ②的平均荧光强度 ・通过比较上述a和b的值来评价SA-β-gal的活性。 另外，通过a减去b的差值可以确定细胞衰老所引起的SA-β-gal活性的变化。 荧光显微镜检测 ・首先，使用未添加SPiDER-βGal的衰老细胞进行荧光观察。 ・调整灵敏度（Gain等），直至来生自脂褐素的荧光（背景）不影响荧光图像为止。 ・在相同的成像条件下，再对添加了SPiDER-βGal的细胞或正常细胞进行荧光观察。 |
| Q6: 细胞固定后还可以对SA-β-gal进行染色吗？ |
| A6: 可以。如果固定细胞，则不需要用Bafilomycin A1预处理细胞，但是需要制备pH调节至6的Mcllvain Buffer。详细的操作请参考操作说明书。 |
| Q7: 请问是否有细胞固定后进行流式细胞仪操作的具体步骤？ |
| A7: 可以。但是请注意细胞固定可能会影响SA-β-gal（请参考下面的*2） 以下的实验例供作参考。 WI-38细胞固定后，进行SA-β-gal检测和γ-H2AX (DNA损伤标志物)的免疫染色。 <实验操作> (1) 将WI-38细胞播种至35 mm dish，37℃，5% CO2培养箱中过夜培养。 (2) 去除上清，加入2 ml 4% P araformaldehyde/PBS溶液，室温培养3 min*1。 (3) 用2 ml PBS清洗细胞3次。 (4) 添加2 ml SPiDER-βGal working solution *2, 37℃培养30 min*3。 (5) 用2 ml PBS清洗细胞2次。 (6) 加入2 ml 0.1% Tritox X-100/PBS, 室温培养30 min。 (7) 用2 ml PBS清洗细胞2次。 (8) 加入 2ml 1% BSA/PBS溶液，室温培养1 h。 (9) 用1% BSA/PBS溶液稀释过的抗γ-H2AX IgG(小鼠来源)，加入至细胞后室温培养1 h (10) 用2 ml PBS清洗细胞3次。 (11) 用1% BSA/PBS溶液稀释过的抗小鼠IgG(Cy5标记)，加入至细胞后室温培养1 h。 (12)去除上清，用2 ml PBS清洗细胞2次后进行荧光显微镜观察。 *1 细胞固定时间越长，对SA-β-gal活性的影响越高。*2 细胞固定操作有可能会降低SA-β-gal的活性。如果检测SA-β-gal时，荧光强度较弱，请尝试将SPiDER-βGal DMSO stock solution 稀释500-1000倍使用。通常SPiDER-βGal DMSO stock solution 建议用Mcllvaine buffer (pH 6.0)稀释2,000倍使用。 *3 培养时不使用5% CO2培养箱。细胞固定后使用5% CO2培养箱的话，缓冲液会变为酸性，从而使得内在性β-galactosidase的活性上升，导致背景升高，无法辨别衰老细胞和年轻细胞的内的SA-β-gal活性的差值。 <实验数据> 通过比较免疫染色前后的SPiDER-βGal的荧光强度，可以发现固定后的免疫染色过程中SPiDER-βGal的荧光强度降低了。 图2. 不同稀释倍率的SPiDER-βGal染色结果 (免疫染色后) 红色：SPiDER-βGal 蓝色：γ-H2AX <曝光时间: 1.5 s>通过将SPiDER-βGal工作溶液的稀释比从2000倍更改为666倍，可以确认通过免疫染色（固定化）降低的SPiDER-βGal荧光强度与免疫染色前的强度相当。 |
| Q8: 染色操作后发现荧光很弱，无法观察，请问是否有改善的方法？ |
| A8: 请确认如下三个注意事项。 ①使用的滤光片是否与染色试剂匹配。 <推荐的滤光片> · 荧光显微镜：激发(500-540 nm)，荧光(530-570 nm) · 流式细胞仪：激发(488 nm), 荧光(500-540 nm) ②各working solution是否为现配现用。 ③延长染色时间 添加SPiDER-βGal working solution后，培养30 min后无法观察到荧光的话，考虑延长至45-60 min再进行荧光观察。 |
| Q9: 确认含有SA-β-Gal的细胞染色后，是否可以进行细胞固定？ |
| A9: 可以。建议使用4%的多聚 甲醛进行细胞固定。 |
| Q10: 培养基中的血清和酚红是否会影响检测？ |
| A10: 培养基中的血清和酚红对SA-β-gal的检测没有影响。 |
| Q11：衰老细胞和正常细胞没有差异时，应该怎么确认？ |
| A11： STEP1：优化显微镜的观察条件。 STEP2：如果优化观察条件仍无法解决，请对染色条件进行优化。STEP1＜优化显微镜的观察条件＞ 如果衰老细胞和对照组细胞之间的荧光强度没有差异，请按照以下步骤进行调整。 1. 观察对照组细胞，通过降低激发光强度，Gain值或缩短曝光时间等条件将仪器调节至可以观察到微弱荧光的状态。 (共聚焦显微镜：调整Gain值、激发光强度 落射型显微镜：调整曝光时间) 2. 慢慢增强激发光强度，延长曝光时间，观察衰老细胞的荧光变化，寻找到衰老细胞和对照组细胞之间的最大荧光差异的条件。 ·如果两者荧光没有差异，请参考STEP2。 ※请使用玻璃底的培养皿容器观察。 STEP2<染色条件的优化> 根据不同的细胞种类，可能需要调整SPiDER-βGal的染色时间和工作液浓度。 以下为最佳条件的参考数据。 染色时间：10-60 min 染色浓度：说明书中1/2-2倍的浓度 分别加入不同浓度的工作液，并调整不同的染色时间，寻找到衰老细胞和对照组细胞之间的最大荧光差异的条件。 *如果观察的细胞数少的话，有可能灵敏度不够。必要时，需要调整细胞数量
|
| Q12.如何准备药物阳性对照组 |
| A12：参考如下案例 衰老诱导（阿霉素处理的WI-38细胞） 1.将第3代的WI-38细胞（1×10^6细胞/皿，MEM，10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素）接种在10 cm培养皿中，并在5％CO2中于37℃培养箱中培养过夜。2.除去培养基，并用10 ml PBS洗涤细胞一次。 3.用无血清MEM制备0.2μmol/ L的阿霉素。 如果没有无血清的培养基，可以使用含血清的培养基。 4.向培养皿中加入阿霉素（10 mL），并在5％CO2培养箱中于37℃培养3天。 5.除去上清液，并用10 ml PBS洗涤细胞一次。 6.向培养皿中加入MEM（10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素），并在5％CO2恒温箱中于37℃培养3天。 7.除去培养基，并用10 ml PBS洗涤细胞一次。 8.胰酶消化细胞，分别用阿霉素和不用阿霉素处理。 |
| 固定细胞成像 1.在8孔ibidi中准备细胞进行测定，并在5％CO2恒温箱中于37℃过夜培养细胞。 2.除去培养基。 用PBS洗涤细胞一次。 向细胞中加入4％多聚 甲醛（PFA）/ PBS溶液，并在室温下孵育3分钟。 3.除去上清液。 用PBS洗涤细胞两次。 4.混合SPiDER-βGal工作溶液（2 mL）和1mg / mL Hoehst 33342（2μl）。 将混合溶液（200μl）加入孔中，并在37℃孵育30分钟。 *我们建议不要在固定细胞实验中使用5％CO2培养箱。如果在5％CO2培养箱中进行培养，则缓冲液的pH值可能会呈酸性。 酸性pH导致内源性β-半乳糖苷酶活性的背景升高，因此很难区分正常细胞和衰老细胞。 5.除去上清液。 用PBS洗涤细胞两次。 6.在荧光显微镜下观察细胞。
|
文献
2023年最 新衰老高分文献解析
| 细胞种类 | 标题及链接 | 仪器 | IF 因子 |
| WT hMPCs细胞 | Senescence atlas reveals an aged-like inflamed niche that blunts muscle regeneration.Nature . 2023 Jandoi: 10.1038/s41586-022-05535-x. |
荧光 | 69.5 |
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荧光 | 66.8 |
| Cancer cells | The chemistry of senescence | 荧光 | 30 |
| Vascular Cells | b-Hydroxybutyrate Prevents Vascular Senescence through hnRNP A1-Mediated Upregulation of Oct4 |
荧光 | 14 |
| RAW 264.7 (小鼠单核巨噬细胞白血病细胞) |
The CD153 vaccine is a senotherapeutic option for preventing the accumulation of senescent T cells in mice | 荧光 | 11.8 |
| HT-1080 (人纤维肉瘤细胞) |
Typhoid toxin exhausts the RPA response to DNA replication stress driving senescence and Salmonella infection | 荧光 | 11.8 |
| OVCAR-3 Cell:人卵巢腺癌细胞系 | Author Manuscript Published OnlineFirst on December 19, 2019; | 流式 | 8.3 |
| neck tumor cells | Interference with the bromodomain epigenome readers drives p21 expression and tumor senescence | 荧光 | 6.5 |
| VZ/SVZ cells | Ecrg4 deficiency extends the replicative capacity of neural stem cells in a Foxg1-dependent manner | 荧光 | 5.7 |
| 骨髓源性间充质干细胞（BMSCs） | Bone marrow-derived mesenchymal stem cells in three-dimensional co-culture attenuate degeneration of nucleus pulposus cells Bone marrow-derived mesenchymal stem cells in three-dimensional co-culture attenuate de | 荧光 | 5.5 |
| 肾组织石蜡切片 | Mitochondrial Protection Partly Mitigates Kidney Cellular Senescence in Swine Atherosclerotic Renal Artery Stenosis,Cellular Physiology and Biochemistry,2019,52,617-632 | 荧光 | 5.1 |
| A549细胞 PC-9人肺癌细胞 |
Novel drug-resistance mechanisms of pemetrexed-treated non-small cell lung cancer,Oncotarget,2018,9(24),16807-1682 |
荧光 | 5.1 |
| 人乳腺癌细胞 | Different sensitivities of senescent breast cancer cells to immune cell-mediated cytotoxicity,Cancer Science, 2019,110,2690–2699 | 流式/荧光 | 4.7 |
| HaCaT细胞系 | Particulate matter-induced senescence of skin keratinocytes involves oxidative stress-dependent epigenetic modifications,Experimental & Molecular Medicine,2019,51, Article number:108 | 荧光 | 4.7 |
| 脂肪来源干细胞 (ADSC) |
Antioxidants inhibit cell senescence and preserve stemness of adipose tissue-derived stem cells by reducing ROS generation during long-term in vitro expansion,Stem Cell Research & Therapy, 2019,10(1),306 |
荧光 | 4.6 |
| HaCaT细胞系 | Effect of Fermented Fish Oil on Fine Particulate Matter-Induced Skin Aging |
流式/荧光 | 4.3 |
| HCT 116 (人结肠癌细胞) |
Heat shock protein 27 promotes cell cycle progression by down-regulating E2F transcription factor 4 and retinoblastoma family protein p130 | 荧光 | 4.1 |
| immortalized cells | Improved Isolation of Mesenchymal Stem Cells Based on Interactions between N-Acetylglucosamine-Bearing Polymers and Cell-Surface Vimentin | 荧光 | 3.9 |
| PC12 cells | b-Asarone Inhibits Amyloid-b by Promoting Autophagy in a Cell Model of Alzheimer's Disease | 荧光 | 3.8 |
| 卵母细胞和卵子 | Activity and intracellular localization of senescence-associated β-galactosidase in aging Xenopus oocytes and eggs | 荧光 | 3 |
| 胶原酶法分离小鼠角膜基质 | Anti-inflammatory activities of Ophiopogonis Radix on hydrogen peroxide-induced cellular senescence of normal human dermal fibroblasts,Journal of Natural Medicines,2018,72(4):905-914 | 流式 | 2.3 |
| 成纤维细胞 (NHDF) |
Anti‑inflammatory activities of Ophiopogonis Radix on hydrogen peroxide‑induced cellular senescence of normal human dermal fibroblast |
荧光 | 1.92 |
| WI-38 (人肺成纤维细胞） |
Changes in MCM2–7 proteins at senescence | 荧光 | 0.8 |
| 骨髓间充质干细胞 | Obesity is associated with senescence of mesenchymal stromal cells derived from bone marrow, subcutaneous and visceral fat of young mice |
流式 |
SPiDER-βGal试剂 货号：SG02
(2S,3R,4S,5R,6R)-2-{[3'-(Diethylamino)-5'-(fluoromethyl)-3H-spiro(isobenzofuran-1,9'-xanthen)-6'-yl]oxy}-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol
CAS号：1824699-57-1
商品信息
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温
分子式：C31H34FNO8 分子量：567.6
特点：
● 活细胞和固定细胞均可染色
● 可用共聚焦显微镜或流式细胞仪检测
● 可染色组织切片
性质
源自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因（lacZ）被广泛用作报告基因分析标记。X-gal染色被广泛用作检测β-半乳糖苷酶的典型方法，但是由于细胞膜通透性差，必须固定细胞和组织。另外由于常规的β-半乳糖苷酶检测荧光剂仅具有较低的细胞内滞留性，所以存在不能清楚地区分不表达β-半乳糖苷酶的细胞和表达β-半乳糖苷酶的细胞的问题。
为了克服这些问题，浦野、神谷等研究者成功开发出了具有细胞膜穿透性和细胞内滞留性的新荧光试剂SPiDER-βGal 。该试剂通过与β-半乳糖苷酶的酶促反应形成中间体醌甲基化物，并与蛋白质中的SH基等亲核基团形成稳定的共价键，并发出荧光。以此方式，将反应的试剂固定在细胞内蛋白上并具有优异的细胞内滞留性，结果证明可以在单个细胞水平上清楚地检测到表达β-半乳糖苷酶的细胞。
原理
SPiDER-βGal的细胞染色原理
SPiDER-βGal透过细胞膜后，在β-半乳糖苷酶的酶促反应下迅速生成醌甲基化物，该产物是一种亲电子化合物，可以和带有-SH等亲核功能基团的蛋白质结合产生荧光，并可以自我固定在细胞内的蛋白质上而滞留在细胞内。
操作步骤
加入试剂 培养15分钟 观察
用缓冲液清洗细胞后， 在避光条件下培养15分钟， 用荧光显微镜或流式细胞仪
加入SPiDER-βGal染色液。 用缓冲液清洗细胞。 观察。
实验例
组织的荧光成像
果蝇组织的实时成像
（数据由东京大学大学院医学系研究科浦野泰幸教授提供）
活细胞和固定细胞的荧光成像
SPiDER-βGal对HEK/LacZ细胞和细胞数比为1:1的HEK细胞的染色图
A.活细胞，B.固定细胞（4％PFA/PBS）
（绿色：SPiDER-βGal，蓝色：Hoechst 33342）
将HEK293细胞和β-半乳糖苷酶稳定表达的HEK/LacZ细胞以1:1的比例混合培养，分别在固定前和固定后用SPiDER-βGal染色，用共聚焦显微镜观察。证实了由于SPiDER-βGal具有很好的膜通透性和能在细胞内长时间滞留，可以在固定前和固定后进行荧光成像。
用流式细胞仪检测表达β-半乳糖苷酶的细胞
使用SPiDER-βGal通过流式细胞仪对HEK/LacZ细胞和HEK细胞分别进行检测。
将HEK293细胞和β-半乳糖苷酶稳定表达的HEK/LacZ细胞以1:1的比例混合并培养，并在用SPiDER-βGal染色后用流式细胞仪进行检测。通过在细胞中滞留的SPiDER-βGal，可以区分β-半乳糖苷酶稳定表达菌株（绿色）和非表达菌株（灰色）。
组织样品中的SA-β-gal检测
有研究人员发表了一篇论文，其中使用糖尿病模型小鼠的组织样本通过SPiDER-βGal检测到了SA-β-gal。
<组织样本的染色条件>
将快速冷冻的组织切片后，将其浸入4％多聚 甲醛中，并在室温下培养20分钟。然后将20 μmol/l SPiDER-βGal加到用PBS洗涤过的样品中，并在37℃培养1小时。 最后将样品用PBS洗涤并观察。
有关实验操作和数据的详细信息，请参阅以下参考文献中的5）。
荧光特性
SPiDER-βGal与β-半乳糖苷酶反应后的激发/发射光谱
<推荐滤波片>
激发：500-540 nm
荧光：530-570 nm
使用共聚焦激光显微镜和流式细胞仪
我们有使用488 nm激发进行检测的记录。
常见问题Q&A
| Q：与现有方法相比是否有相关性以及这个方法的优点。 |
| A：①可用于活细胞。我们证实与同样用于活细胞的GFP融合蛋白表达细胞的方法存在相关性。 （2）与GFP方法相比，即使固定后也可以观察到荧光。 （3）与现有的小分子量β-半乳糖苷酶荧光检测试剂相比，具有优异的“细胞膜通透性”和“细胞内滞留性”，因此可以在单个表达β-半乳糖苷酶的细胞上染色。 |
| Q：除了Hanks' HEPES以外，还可以用其它工作液吗？ |
| A：可以使用PBS，HBSS等。 |
| Q：工作液稳定吗？ |
| A：不能长时间保存，需要现配现用。 |
| Q：可以用流式细胞仪检测吗？ |
| A：可以，用流式细胞仪可以检测β-半乳糖苷酶表达和未表达的HEK细胞的混合样品并分离。 在说明上有操作步骤和实验条件。 |
| Q：是否可以固定后再对样品染色？ |
| A：可以，即使用4%的多聚 甲醛或甲醇固定，也可以进行荧光观察。由于固定会降低β-半乳糖苷酶的活性，请摸索最佳固定条件。 |
| Q：推荐的滤光片。 |
| A：建议使用以下滤光片。 ・荧光显微镜：激发（500-540 nm），荧光（500-540 nm） ・流式细胞仪：激发（488 nm），荧光（500-540 nm） 请参考说明书中的“激发/发射光谱”和实验例。 |
| Q：样品染色后是否可以固定？ |
| A：可以。即使将其固定在4％多聚 甲醛或甲醇中，也可以观察到荧光。 |
| Q：是否可以染组织？ |
| A：可以。与细胞染色相比，组织染色需要增加工作液的浓度（例如10-20 μmol/l）， 我们有组织染色的实验例。 |
参考文献
| 文献No | 文献 | 年 | IF |
| 1 | Senescence atlas reveals an aged-like inflamed niche that blunts muscle regeneration.Nature | 2023 | 69.5 |
| 2 | Resurrection of endogenous retroviruses during aging reinforces senescence.Cell.2023 Jan 19 | 2023 | 66.8 |
| 3 | Endothelial progeria induces adipose tissue senescence and impairs insulin sensitivity through senescence associated secretory phenotype,Nature Commun.,2020,11,481. | 2020 | 17.6 |
| 4 | β-Hydroxybutyrate Prevents Vascular Senescence through hnRNP A1-Mediated Upregulation of Oct4,Molecular Cell,2019,71,1064-1078. | 2019 | 15.2 |
| 5 | Activity and intracellular localization of senescence-associated β-galactosidase in aging Xenopus oocytes and eggs,Exp. Gerontol.,2019,119,157. | 2019 | 0.9 |
| 6 | Ecrg4 deficiency results in extended replicative capacity of neural stem cells in a Foxg1-dependent manner,Development,2019,doi:10.1242/dev.168120 . | 2019 | 6.2 |
| 7 | B.L. Torres, A. Estepa-Fernandez, M. Rovira, M.Oraez, M. Serrano, R. Martinez-Manez and F.Sancenon,"The chemistry of senescence.", Thechemistry of senescence., 2019, (3), 426-411 | 2019 | 2.7 |
| 8 | Interference with the bromodomain epigenome readers drives p21 expression and tumor senescence,Cancer Letters,2019,461,10–20 | 2019 | 6.5 |
| 9 | Ecrg4 deficiency extends the replicative capacity of neural stem cells in a Foxg1-dependent manner,Development,2019,dev168120 | 2019 | 5.7 |
| 10 | Mitochondrial protection partly mitigates kidney cellular senescence in swine atherosclerotic renal artery stenosis,Cell Physiol Biochem,2019,52(3),617–632 | 2019 | 5.1 |
| 11 | Ryosuke Tanino,et al.,Novel drug-resistance mechanisms of pemetrexed-treated non-small cell lung cancer,Oncotarget,2018,9(24),16807-16821 | 2018 | 5.1 |
| 12 | Park AM,et al.,Heat shock protein 27 promotes cell cycle progression by down-regulating E2F transcription factor 4 and retinoblastoma family protein p130,The Journal of Biological Chemistry, 2018,293(41),15815-15826 | 2018 | 4.1 |
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| 14 | Ryoei Uchida,et al.,Epigenetic silencing of Lgr5 induces senescence of intestinal epithelial organoids during the process of aging，Nature Partner Journal：Aging and Mechanisms of Disease,2018 | 2018 | 1.3 |
| 15 | Treatment of diabetic mice with the SGLT2 inhibitor TA-1887 antagonizes diabetic cachexia and decreases mortality,NPJ. Aging Mech. Dis.,2017, DOI:10.1038/s41514-017-0012-0. | 2017 | |
| 16 | T. Sugizaki,et al.,Treatment of diabetic mice with the SGLT2 inhibitor TA-1887 antagonizes diabetic cachexia and decreases mortality，Nature Partner Journal：Aging and Mechanisms of Disease，2017,3,12 | 2017 | 1.3 |
| 17 | Developmental vascular remodeling defects and postnatal kidney failure in mice lacking Gpr116 (Adgrf5) and Eltd1 (Adgrl4),PLoS ONE.,2017,10.1371/journal.pone.0183166. | 2017 | 3.7 |
| 18 | A topically-sprayable, activatable fluorescent and retaining probe, SPiDER-βGal for detecting cancer; Advantages of anchoring to cellular proteins after activation ,Oncotarget,2017,doi:10.18632/oncotarget.17080. | 2017 | 4.3 |
| 19 | Changes in expression of C2cd4c in pancreatic endocrine cells during pancreatic development,FEBS Lett.,2016,doi:10.1002/1873-3468.12271 | 2017 | 3.8 |
| 20 | Detection of LacZ-Positive Cells in Living Tissue with Single-Cell Resolution,Angew. Chem. Int. Ed. Engl.,2016,doi:10.1002/anie.201603328 | 2016 |
Cellular Senescence Plate Assay Kit - SPiDER-βGal试剂盒 货号：SG05
细胞衰老培养板检测试剂盒（SPiDER-βGal）
Cellular Senescence Plate Assay Kit - SPiDER-βGal
商品信息
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温
特点：
● 可用于SA-β-gal活性的定量和多个样品的评估
● 使用酶标仪检测
试剂盒内含
原理
该产品是一种试剂盒，可通过细胞培养板轻松检测SA-β-gal（细胞衰老相关的β-半乳糖苷酶）活性，SA-β-gal是衰老细胞的指标。 SPiDER-βGal是一种β-半乳糖苷酶检测试剂，只需将试剂添加到96孔板中，即可用于SA-β-gal活性的定量和多个样品的评估。
根据细胞数的SA-β-gal活性可以通过计算该细胞数，测量核酸（相关产物）的量或蛋白质的量来校正。并通过该试剂盒获得的测量值来评估衰老程度。
操作步骤
轻松量化衰老细胞
预先准备的细胞在该试剂盒随附的缓冲液中裂解。只需将荧光底物SPiDER-βGal加到细胞裂解液中，即可根据SA-β-gal活性检测荧光强度。
即使在10 cm培养皿或其它容器中制备细胞，也可以通过在细胞裂解后将细胞裂解液转移到96孔板上来检测荧光强度。
实验例
与荧光成像结果的相关性：
用平板分析法和细胞衰老检测试剂盒-SPiDER-βGal对不同传代水平的WI-38细胞进行荧光成像实验结果。
结果证实了在2种试剂盒中，SA-β-gal染色在高传代的WI-38细胞中荧光强度有明显增强。
请注意尽管初始细胞接种密度是相同的，但由于较高传代水平下衰老细胞的增殖率较低，因此平板分析时的细胞密度会有所不同。在本实验中我们用检测细胞核的细胞计数标准化试剂盒（货号：C544）获得的结果来校正SA-β-gal活性。
平板测定<检测条件>
EX:535 nm/Em:580nm
荧光数据<检测条件>
绿色：EX:488 nm/Em:500-600nm
（用细胞衰老检测试剂盒(货号SG03)对SA-β-Gal进行染色
蓝色：EX:405 nm/Em:450-495 nm
（用DAPI溶液进行核染色（货号：D523））
加药实验：
加入阿霉素后，我们使用该试剂盒对WI-38细胞进行了分析，阿霉素会增加线粒体活性氧（ROS）的产生。结果证实由于DNA损伤诱导的衰老，向WI-38细胞中添加阿霉素会引起SA-β-gal的染色强度增加。
＜检测条件＞
Ex:535 nm/Em:580 nm
注意事项
用微孔板分析细胞时，会由于孔中细胞的数量不同导致结果可能不同。在此情况下，有必要通过对细胞进行计数并检查蛋白质总量来校正（标准化）获得的测量值。使用细胞计数标准化试剂盒，只需将试剂加到细胞培养基中，即可通过对细胞核染色获得的荧光强度轻松检测细胞数量。
有关细胞计数标准化试剂盒（货号：C544）的产品信息请点击这里
常见问题Q&A
| Q1：1个试剂盒可检测多少样品？ |
| A1： |
| 20 tests | 100 tests | |
| 检测数量 | 96孔板20个孔 | 1块96孔板 |
| 当n=3时 | 6个样品 | 30个样品 |
| Q2：是否可以先诱导衰老然后在96孔板上进行检测？ |
| A2：建议先用培养皿诱导细胞衰老，然后将细胞转移到96孔板中进行检测。 将未诱导衰老的细胞（对照）和诱导衰老的细胞（样品）放在同一块板上进行比较，如果在96孔板上诱导衰老时（取决于衰老诱导的天数），会发生细胞过度生长并导致细胞融合的情况。 另外即使预先接种少量细胞以避免融合，已经进行了衰老诱导处理的衰老细胞也可能不具有平板测定所需的灵敏度（细胞数）。 |
| Q3：在96孔板上应接种多少细胞？ |
| A3：最佳细胞数取决于细胞类型。 我们曾经在每个孔中接种1╳104个WI-38细胞进行实验。 更多详细操作，请参照说明书中的“实验例”。 |
相关文献
1、Y. Takenaka, I. Inoue, T. Nakano, M. Ikeda and Y. Kakinuma, "Prolonged disturbance of proteostasis induces cellular senescence via temporal mitochondrial dysfunction and subsequent mitochondrial accumulation in human fibroblasts", 2021, doi:10.1111/febs.16249.
2、H. Yamamoto-Imoto, S. Minami, T. Shioda, Y. Yamashita, S. Sakai, S. Maeda, T. Yamamoto, S. Oki, M. Takashima, T. Yamamuro, K. Yanagawa, R. Edahiro, M. Iwatani, M. So, A. Tokumura, T. Abe, R. Imamura, N. Nonomura, Y. Okada, D. E. Ayer, H. Ogawa, E. Hara, Y. Takabatake, Y. Isaka, S. Nakamura and T. Yoshimori, "Age-associated decline of MondoA drives cellular senescence through impaired autophagy and mitochondrial homeostasis", Cell Rep., 2022, doi:10.1016/j.celrep.2022.110444.
DNA Damage Detection Kit - γH2AX - Green 货号：G265
DNA损伤检测试剂盒- - γH2AX -绿色
Cellular Senescence Detection Kit - SPiDER-βGal共染，检测衰老细胞DNA损伤
商品信息
储存条件：0-5°C，注意防止吸潮
运输条件：常温
特点：
● 无需另外准备试剂
● 操作简便
● 3色可选
试剂盒内含
性质
该试剂盒，可通过二抗的方法轻松检测出作为DNA损伤的指标γH2AX。 本试剂盒内包含了实验所需的所有试剂，即使是第一次使用的人操作起来也很方便，并且我们还将介绍使用γH2AX作为指标的文献及实验例以供参考。
DNA损伤检测原理
DNA损伤中经常会出现DNA双链断裂，H2AX（一种组蛋白H2X的亚种），当出现DNA双链断裂时，会迅速而大量地被磷酸化。 这种磷酸化的H2AX（γH2AX），作为DNA损伤的标志物，有望被用来作为评估化学物质，活性氧，紫外线，辐射等的遗传毒性和致癌性。 近年来，γH2AX的检测也被用来作为评价细胞衰老的一种指标。
该产品使用单克隆抗体实验室生产的抗γH2AX抗体。
试剂盒特点
<试剂盒内已包含所有需要试剂>
所有试剂均已包含在试剂盒内，您可以马上检测并获得数据。
*对于多次染色和组织染色，请先查看常见问题中的“多次染色的注意事项”和“组织染色的注意事项”。
<操作简便>
细胞固定和膜渗透处理后，只需添加试剂盒中包含的试剂并进行洗涤即可进行染色。
<3色可选>
细胞固定和膜渗透处理后，只需添加试剂盒中包含的试剂并进行洗涤即可进行染色。
| 产品名称 | 荧光 | 激发发射波长 |
| DNA Damage Detection Kit - γH2AX - Green | 绿色 | λex : 494 nm、λem : 518 nm |
| DNA Damage Detection Kit - γH2AX - Red | 红色 | λex : 550 nm、λem : 566 nm |
| DNA Damage Detection Kit - γH2AX - Deep Red | 深红色 | λex : 646 nm、λem : 668 nm |
细胞衰老实验例
在评估细胞衰老时，应使用多种衰老指标进行分析。
<细胞衰老实验例>
| 概要 | 检测指标 | 论文 |
| 在自噬不足的卫生细胞中检测到细胞衰老，相反，通过添加自噬诱导剂后，细胞衰老被抑制。 | γH2AX、SA-β-gal、p16、p21 |
Laura Garcia-Prat, et. al., Nature, 2016, 529, 37. |
| 在2型糖尿病模型中，证实了衰老指标活性增加，DNA损伤水平增加。 | γH2AX、SA-β-gal、p21 |
Milad S. Bitar, et. al., Am J Physiol Endocrinol Metab, 2013, 305(8), E951. |
| 在缺乏特定蛋白质（BRE）的小鼠成纤维细胞中，观察到细胞衰老明显增强。 | γH2AX、SA-β–gal | W. Shi, M. K. Tang, Y. Yao, C. Tang, Y. L. Chui and K. K. Lee Sci Rep. , 2016, 6, 23506. |
| 在棕榈酸处理的HepG2细胞中，染色质结构突变复合物之一SMARCD1减少，所有衰老指标的活性均得到增强。 | γH2AX、SA-β-gal、p16、p21 |
I. Chisato, et. al., NPJ Aging Mech Dis., 2017, 3, 11. |
| 在参与DNA修复的Ercc1基因缺陷小鼠中，证实了仅通过自发DNA损伤即会导致ROS水平升高和衰老诱导。 | γH2AX、SA-β-gal、p16 |
R. R. Andria, et. Al., Redox Biology, 2018, 17, 259. |
<结合其他指标的细胞实验例>
<染色条件>
将不同代数的WI-38细胞固定后，用细胞衰老检测试剂盒-SPiDER-βGal对其进行染色。
使用0.1％Triton-X / PBS进行膜渗透处理后，用该试剂盒对γH2AX进行染色。
<检测条件>
H2AX（深红色）：Ex.590-650 nm / Em.663-738 nm
SA-β-gal：Ex.533-557 nm / Em.570-640 nm
DAPI：Ex.340-380 nm / Em.435-485 nm
参考文献
1. J. Takahashi, S. Nagasawa, M. J. Ikemoto, C. Sato, M. Sto and H. Iwahashi, "Verification of 5-Aminolevurinic Radiodynamic Therapy Using a Murine Melanoma Brain Metastasis Model", Int. J. Mol. Sci. ., 2019, 20, (5155) .
2. M. Komura, T. Sata, H. Yoshikawa, N. A. Nitta, Y. Suzuki, K KOike, Y. Kodama, K. Seyama and K. Takahashi, "Propylene glycol, a component of electronic cigarette liquid, damages epithelial cells in human small airways", 2022, Respir. Res., doi:10.1186/s12931-022-02142-2.
常见问题Q&A
| Q：抗γH2AX抗体工作液和二抗工作液是否可以保存？ |
| A：无法保存，请当天使用。 |
| Q：可以使用试剂盒内含的封闭液以外，其他的试剂进行稀释抗体吗？ |
| A：我们建议使用试剂盒内含的封闭液进行稀释。 用其他溶液稀释可能会增加背景。 |
| Q：多重染色的注意点 |
| A：由于该试剂盒使用源自小鼠的一抗，因此在共染色其他抗原时，请选择小鼠来源的一抗以外的一抗。 |
| Q：组织染色的注意点 |
| 请注意，不能用于小鼠组织的组织染色。 当需要对小鼠组织进行染色时，抗小鼠抗体（荧光标记的二抗）会对小鼠组织中IgG的非特异性吸附，从而增加背景。 <试剂盒中包含的抗体信息> |
| 来源 | 交叉性 | |
| 一抗 | 小鼠 | 人、小鼠 |
| 荧光标记的二抗 | 山羊 | 小鼠IgG |
DNA Damage Detection Kit - γH2AX - Red 货号：G266
DNA损伤检测试剂盒- - γH2AX -红色
Cellular Senescence Detection Kit - SPiDER-βGal共染，检测衰老细胞DNA损伤
商品信息
储存条件：0-5°C，注意防止吸潮
运输条件：常温
试剂盒内含
性质
该试剂盒，可通过二抗的方法轻松检测出作为DNA损伤的指标γH2AX。 本试剂盒内包含了实验所需的所有试剂，即使是第一次使用的人操作起来也很方便，并且我们还将介绍使用γH2AX作为指标的文献及实验例以供参考。
DNA损伤检测原理
DNA损伤中经常会出现DNA双链断裂，H2AX（一种组蛋白H2X的亚种），当出现DNA双链断裂时，会迅速而大量地被磷酸化。 这种磷酸化的H2AX（γH2AX），作为DNA损伤的标志物，有望被用来作为评估化学物质，活性氧，紫外线，辐射等的遗传毒性和致癌性。 近年来，γH2AX的检测也被用来作为评价细胞衰老的一种指标。
该产品使用单克隆抗体实验室生产的抗γH2AX抗体。
试剂盒特点
<试剂盒内已包含所有需要试剂>
所有试剂均已包含在试剂盒内，您可以马上检测并获得数据。
*对于多次染色和组织染色，请先查看常见问题中的“多次染色的注意事项”和“组织染色的注意事项”。
<操作简便>
细胞固定和膜渗透处理后，只需添加试剂盒中包含的试剂并进行洗涤即可进行染色。
<3色可选>
细胞固定和膜渗透处理后，只需添加试剂盒中包含的试剂并进行洗涤即可进行染色。
| 产品名称 | 荧光 | 激发发射波长 |
| DNA Damage Detection Kit - γH2AX - Green | 绿色 | λex : 494 nm、λem : 518 nm |
| DNA Damage Detection Kit - γH2AX - Red | 红色 | λex : 550 nm、λem : 566 nm |
| DNA Damage Detection Kit - γH2AX - Deep Red | 深红色 | λex : 646 nm、λem : 668 nm |
试剂盒实验例
在评估细胞衰老时，应使用多种衰老指标进行分析。
<细胞衰老实验例>
| 概要 | 检测指标 | 论文 |
| 在自噬不足的卫生细胞中检测到细胞衰老，相反，通过添加自噬诱导剂后，细胞衰老被抑制。 | γH2AX、SA-β-gal、p16、p21 |
Laura Garcia-Prat, et. al., Nature, 2016, 529, 37. |
| 在2型糖尿病模型中，证实了衰老指标活性增加，DNA损伤水平增加。 | γH2AX、SA-β-gal、p21 |
Milad S. Bitar, et. al., Am J Physiol Endocrinol Metab, 2013, 305(8), E951. |
| 在缺乏特定蛋白质（BRE）的小鼠成纤维细胞中，观察到细胞衰老明显增强。 | γH2AX、SA-β–gal | W. Shi, M. K. Tang, Y. Yao, C. Tang, Y. L. Chui and K. K. Lee Sci Rep. , 2016, 6, 23506. |
| 在棕榈酸处理的HepG2细胞中，染色质结构突变复合物之一SMARCD1减少，所有衰老指标的活性均得到增强。 | γH2AX、SA-β-gal、p16、p21 |
I. Chisato, et. al., NPJ Aging Mech Dis., 2017, 3, 11. |
| 在参与DNA修复的Ercc1基因缺陷小鼠中，证实了仅通过自发DNA损伤即会导致ROS水平升高和衰老诱导。 | γH2AX、SA-β-gal、p16 |
R. R. Andria, et. Al., Redox Biology, 2018, 17, 259. |
<结合其他指标的细胞实验例>
<染色条件>
将不同代数的WI-38细胞固定后，用细胞衰老检测试剂盒-SPiDER-βGal对其进行染色。
使用0.1％Triton-X / PBS进行膜渗透处理后，用该试剂盒对γH2AX进行染色。
<检测条件>
H2AX（深红色）：Ex.590-650 nm / Em.663-738 nm
SA-β-gal：Ex.533-557 nm / Em.570-640 nm
DAPI：Ex.340-380 nm / Em.435-485 nm
常见问题Q&A
| Q：抗γH2AX抗体工作液和二抗工作液是否可以保存？ |
| A：无法保存，请当天使用。 |
| Q：可以使用试剂盒内含的封闭液以外，其他的试剂进行稀释抗体吗？ |
| A：我们建议使用试剂盒内含的封闭液进行稀释。 用其他溶液稀释可能会增加背景。 |
| Q：多重染色的注意点 |
| A：由于该试剂盒使用源自小鼠的一抗，因此在共染色其他抗原时，请选择小鼠来源的一抗以外的一抗。 |
| Q：组织染色的注意点 |
| 请注意，不能用于小鼠组织的组织染色。 当需要对小鼠组织进行染色时，抗小鼠抗体（荧光标记的二抗）会对小鼠组织中IgG的非特异性吸附，从而增加背景。 <试剂盒中包含的抗体信息> |
| 来源 | 交叉性 | |
| 一抗 | 小鼠 | 人、小鼠 |
| 荧光标记的二抗 | 山羊 | 小鼠IgG |
DNA Damage Detection Kit - γH2AX - Deep Red 货号：G267
DNA损伤检测试剂盒- - γH2AX -深红色
Cellular Senescence Detection Kit - SPiDER-βGal共染，检测衰老细胞DNA损伤
商品信息
储存条件：0-5°C，注意防止吸潮
运输条件：常温
试剂盒内含
性质
该试剂盒，可通过二抗的方法轻松检测出作为DNA损伤的指标γH2AX。 本试剂盒内包含了实验所需的所有试剂，即使是第一次使用的人操作起来也很方便，并且我们还将介绍使用γH2AX作为指标的文献及实验例以供参考。
DNA损伤检测原理
DNA损伤中经常会出现DNA双链断裂，H2AX（一种组蛋白H2X的亚种），当出现DNA双链断裂时，会迅速而大量地被磷酸化。 这种磷酸化的H2AX（γH2AX），作为DNA损伤的标志物，有望被用来作为评估化学物质，活性氧，紫外线，辐射等的遗传毒性和致癌性。 近年来，γH2AX的检测也被用来作为评价细胞衰老的一种指标。
该产品使用单克隆抗体实验室生产的抗γH2AX抗体。
试剂盒特点
<试剂盒内已包含所有需要试剂>
所有试剂均已包含在试剂盒内，您可以马上检测并获得数据。
*对于多次染色和组织染色，请先查看常见问题中的“多次染色的注意事项”和“组织染色的注意事项”。
<操作简便>
细胞固定和膜渗透处理后，只需添加试剂盒中包含的试剂并进行洗涤即可进行染色。
<3色可选>
细胞固定和膜渗透处理后，只需添加试剂盒中包含的试剂并进行洗涤即可进行染色。
| 产品名称 | 荧光 | 激发发射波长 |
| DNA Damage Detection Kit - γH2AX - Green | 绿色 | λex : 494 nm、λem : 518 nm |
| DNA Damage Detection Kit - γH2AX - Red | 红色 | λex : 550 nm、λem : 566 nm |
| DNA Damage Detection Kit - γH2AX - Deep Red | 深红色 | λex : 646 nm、λem : 668 nm |
细胞衰老实验例
在评估细胞衰老时，应使用多种衰老指标进行分析。
<细胞衰老实验例>
| 概要 | 检测指标 | 论文 |
| 在自噬不足的卫生细胞中检测到细胞衰老，相反，通过添加自噬诱导剂后，细胞衰老被抑制。 | γH2AX、SA-β-gal、p16、p21 |
Laura Garcia-Prat, et. al., Nature, 2016, 529, 37. |
| 在2型糖尿病模型中，证实了衰老指标活性增加，DNA损伤水平增加。 | γH2AX、SA-β-gal、p21 |
Milad S. Bitar, et. al., Am J Physiol Endocrinol Metab, 2013, 305(8), E951. |
| 在缺乏特定蛋白质（BRE）的小鼠成纤维细胞中，观察到细胞衰老明显增强。 | γH2AX、SA-β–gal | W. Shi, M. K. Tang, Y. Yao, C. Tang, Y. L. Chui and K. K. Lee Sci Rep. , 2016, 6, 23506. |
| 在棕榈酸处理的HepG2细胞中，染色质结构突变复合物之一SMARCD1减少，所有衰老指标的活性均得到增强。 | γH2AX、SA-β-gal、p16、p21 |
I. Chisato, et. al., NPJ Aging Mech Dis., 2017, 3, 11. |
| 在参与DNA修复的Ercc1基因缺陷小鼠中，证实了仅通过自发DNA损伤即会导致ROS水平升高和衰老诱导。 | γH2AX、SA-β-gal、p16 |
R. R. Andria, et. Al., Redox Biology, 2018, 17, 259. |
<结合其他指标的细胞实验例>
<染色条件>
将不同代数的WI-38细胞固定后，用细胞衰老检测试剂盒-SPiDER-βGal对其进行染色。
使用0.1％Triton-X / PBS进行膜渗透处理后，用该试剂盒对γH2AX进行染色。
<检测条件>
H2AX（深红色）：Ex.590-650 nm / Em.663-738 nm
SA-β-gal：Ex.533-557 nm / Em.570-640 nm
DAPI：Ex.340-380 nm / Em.435-485 nm
常见问题Q&A
| Q：抗γH2AX抗体工作液和二抗工作液是否可以保存？ |
| A：无法保存，请当天使用。 |
| Q：可以使用试剂盒内含的封闭液以外，其他的试剂进行稀释抗体吗？ |
| A：我们建议使用试剂盒内含的封闭液进行稀释。 用其他溶液稀释可能会增加背景。 |
| Q：多重染色的注意点 |
| A：由于该试剂盒使用源自小鼠的一抗，因此在共染色其他抗原时，请选择小鼠来源的一抗以外的一抗。 |
| Q：组织染色的注意点 |
| 请注意，不能用于小鼠组织的组织染色。 当需要对小鼠组织进行染色时，抗小鼠抗体（荧光标记的二抗）会对小鼠组织中IgG的非特异性吸附，从而增加背景。 <试剂盒中包含的抗体信息> |
| 来源 | 交叉性 | |
| 一抗 | 小鼠 | 人、小鼠 |
| 荧光标记的二抗 | 山羊 | 小鼠IgG |
Nucleolus Bright Green试剂 货号：N511
核仁荧光染色试剂-绿色
Nucleolus Bright Green
商品信息
储存条件：避光，在冷暗处保存
运输条件：室温
特点：
● 高特异性核仁定位
● 可通过共聚焦定量细胞成像仪进行定量分析
● 两种颜色可供选择
产品概述
Nucleolus Bright是一种选择性与RNA结合并产生荧光的小分子荧光染料，只需在固定细胞中加入试剂即可成像。虽然Nucleolus Bright也会和在核仁以外存在的RNA反应，不过核仁作为细胞内RNA最多存在rRNA的产生场所，荧光尤为强烈。
成像时，通过与核染色试剂DAPI[产品货号：D523]共染色，可以更清楚地确认核仁。有关详细信息，请参阅使用说明书中的实验例。
原理
核仁是不带膜的核内结构体，也是核糖体生物合成的起点。核仁中存在许多核糖体RNA(rRNA)，并且是 rRNA基因转录以及合成加工的场所。由于蛋白质合成的早期阶段在核仁中进行，因此核仁的变化被认为与多种细胞活动有关。核仁的形态变化已被公认为判断癌症的指标之一，近年来也有一系列的报道论述了核仁应激与DNA损伤、自噬、病毒感染和细胞衰老的关系，因此核仁在这些方面的研究也受到越来越多的关注。
核仁染色试剂的比较
| 最大激发波长 | 最大发射波长 |
MeOH固定后染色 | PFA固定后染色 | 活细胞染色 | |
| Nucleolus Bright Green |
513 nm | 538 nm | 〇 | 〇 | △※ |
| Nucleolus Bright Red | 537 nm | 605 nm | 〇 | 〇 | △※ |
※希望通过活细胞进行评价时，请咨询公司技术支持。
产品特点
特点1：清晰地观察核仁
用4％ PFA或MeOH固定HeLa细胞后，用PBS洗净后用1％ Triton X-100进行破膜处理，加入Nucleolus Bright Green或Red和核染色
试剂 (DAPI) 并培养，然后用共聚焦荧光显微镜观察。
结果证实DAPI染色的细胞核内 (蓝色)有数个核仁存在。
<染色条件>
・PFA 固定
细胞在4％PFA室温下浸泡5 min，再用Triton X-100在室温下浸泡20 min，加入各种荧光探针后培养5 min。
・MeOH 固定
细胞在冷的MeOH中浸泡1 min，再用Triton X-100在室温下浸泡20 min，加入各种荧光探针后培养5 min。
| <检测条件> |
Nucleolus Bright Green Ex: 488 nm / Em: 500-600 nm
Nucleolus Bright Red Ex: 561 nm / Em: 565-650 nm
DAPI Ex: 405 nm / Em: 450-495 nm
特点2：核仁定位
用4％PFA固定WI-38细胞后，用抗Fibrillarin一抗和荧光标记的二抗免疫染色，并加入Nucleolus Bright Green或Red和核染色试剂
(DAPI) ，培养后，用落射式荧光显微镜 (Keyence，BZ-X710) 观察。
结果证实Nucleolus Bright Green和Nucleolus Bright Red与核仁标记物(Dense Fibrillar Component)的染色部位一致。
＜检测条件＞
Nucleolus Bright Green：Ex: 450-490 nm / Em: 500-550 nm
Nucleolus Bright Red：Ex: 533-548 nm / Em: 570-640 nm
DAPI：Ex: 340-380 nm / Em: 435-485 nm
Anti-Fibrillarin 抗体：Ex: 590-650 nm / Em: 668-733 nm
特点:3：与核仁相关的领域的报告示例
| 相关领域 | 概要 | 文献 | ||
| 评论(衰老） | 关于各种参与细胞功能的核仁， 包括与癌症和早老症的已知关系、 特别是关于衰老的核仁功能。 |
V. Tiku, A. Antebi, “Nucleolar Function in Lifespan Regulation.”, Trends Cell Biol., 2018, 28(8), 662. | ||
| 细胞衰老 | 由于与抑制衰老有关的蛋白质缺损、 核仁数量的减少和核仁总面积的加。 |
H. Tanaka, S. Takebayashi, A. Sakamoto, T. Igata, Y. Nakatsu, N. Saitoh, S. Hino, M. Nakao, “The SETD8/PR-Set7 Methyltransferase Functions as a Barrier to Prevent Senescence-Associated Metabolic Remodeling.”, Cell Rep.,2017, 18(9), 2148. | ||
| 细胞衰老 | 由于rRNA加工因子的枯竭导致 核仁肥大化， 同时SA-βGal和p16表达增加。 |
K. Nishimura, T. Kumazawa, T. Kuroda, N. Katagiri, M. Tsuchiya, N. Goto, R. Furumai, A. Murayama, J. Yanagisawa, K. Kimura, “Perturbation of ribosome biogenesis drives cells into senescence through 5S RNP-mediated p53 activation.”, Cell Rep., 2015, 10(8), 1310. | ||
| 自噬 | 通过抑制RNA聚合酶的转录， 确认自噬的诱导和核仁的形状变化。 |
N. Katagiri, T. Kuroda, H. Kishimoto, Y. Hayashi, T. Kumazawa and K. Kimura, “The nucleolar protein nucleophosmin is essential for autophagy induced by inhibiting Pol I transcription”, Scientific Reports, 2015, 8903, DOI: 10.1038/srep08903. | ||
衰老细胞的评价例
将不同传代数的WI-38细胞用4％ PFA固定后，用PBS洗净并用1％ Triton X-100进行破膜处理，然后加入Nucleolus Bright Green或
Red和核染色试剂 (DAPI)，培养后用共聚焦荧光显微镜观察。
结果证实第3代细胞 (P3) 中的一个细胞核内存在多个核仁，而第18代细胞 (P18) 中核仁变大并成为一体。
<染色条件>
细胞在4％ PFA室温下浸泡5 min，再用Triton X-100在室温下浸泡20 min，加入各种荧光探针后培养5 min。
＜检测条件＞
Nucleolus Bright Green Ex: 488 nm / Em: 500-600 nm
Nucleolus Bright Red Ex: 561 nm / Em: 565-650 nm
DAPI Ex: 405 nm / Em: 450-495 nm
产品实验例
实验例：通过共聚焦定量细胞成像仪进行定量分析
使用共聚焦定量细胞成像仪 (横河电机株式会社 CQ1)对衰老细胞的定量分析。
将传代数不同的WI-38细胞固定后，分别用Nucleolus Bright Green和DAPI染色核仁，并用共聚焦定量细胞成像仪进行定量分析
通过图像对核仁进行分析
用共聚焦定量细胞成像仪在405nm处拍摄细胞核图像，在488nm处拍摄核仁体像，通过分析软件Cell Pathfinder识别各个细胞核内的核仁，并计算出其数量。
横河电机CQ1拍摄条件
使用板：96孔板
物镜：40倍
激发波长：
405nm（DAPI）：蓝色
488nm（Nucleolus Bright Green）：绿色
视野：16视野
<解析图像>
蓝框线：核
红框线：核仁
核仁数分析
在传代数较多的细胞中，得到了一个细胞核中只有一个核仁的比例增加，而两个及以上核仁的比例减少的结果。该结果与下述论文中衰老的WI-38细胞中核仁数的减少(论文中的Table3)*1，以及通过SETD8敲低诱导衰老的细胞核仁的变化(论文中的Figure4D)*2得到了相同的结果。
*1 P. M. Bemiller, L. Lee, “Nucleolar changes in senescing WI-38 cells”, Mech. Ageing Dev., 1978, 8 , 417.
*2 H. Tanaka, S. Takebayashi, A. Sakamoto, T. Igata, Y. Nakatsu, N. Saitoh, S. Hino, M. Nakao, “The SETD8/PR-Set7 Methyltransferase Functions as a Barrier to Prevent Senescence-Associated Metabolic Remodeling.”, Cell Rep., 2017, 18(9), 2148.
荧光特性
常见问题Q&A
| Q1：可以染色活细胞吗？ |
| A1：本试剂建议用于固定细胞染色，不建议用活细胞染色。如果您想用活细胞染色，请联系我们的技术支持。 |
Nucleolus Bright Red试剂 货号：N512
核仁荧光染色试剂-红色
Nucleolus Bright Red
商品信息
储存条件：冷暗处保存
运输条件：室温
特点：
● 高特异性核仁定位
● 可通过共聚焦定量细胞成像仪进行定量分析
● 两种颜色可供选择
产品概述
Nucleolus Bright是一种选择性与RNA结合并产生荧光的小分子荧光染料，只需在固定细胞中加入试剂即可成像。虽然Nucleolus Bright也会和在核仁以外存在的RNA反应，不过核仁作为细胞内RNA最多存在rRNA的产生场所，荧光尤为强烈。
成像时，通过与核染色试剂DAPI[产品货号：D523]共染色，可以更清楚地确认核仁。有关详细信息，请参阅使用说明书中的实验例。
原理
核仁是不带膜的核内结构体，也是核糖体生物合成的起点。核仁中存在许多核糖体RNA(rRNA)，并且是 rRNA基因转录以及合成加工的场所。由于蛋白质合成的早期阶段在核仁中进行，因此核仁的变化被认为与多种细胞活动有关。核仁的形态变化已被公认为判断癌症的指标之一，近年来也有一系列的报道论述了核仁应激与DNA损伤、自噬、病毒感染和细胞衰老的关系，因此核仁在这些方面的研究也受到越来越多的关注。
核仁染色试剂的比较
| 最大激发波长 | 最大发射波长 |
MeOH固定后染色 | PFA固定后染色 | 活细胞染色 | |
| Nucleolus Bright Green |
513 nm | 538 nm | 〇 | 〇 | △※ |
| Nucleolus Bright Red | 537 nm | 605 nm | 〇 | 〇 | △※ |
※希望通过活细胞进行评价时，请咨询公司技术支持。
产品特点
特点1：清晰地观察核仁
用4％ PFA或MeOH固定HeLa细胞后，用PBS洗净后用1％ Triton X-100进行破膜处理，加入Nucleolus Bright Green或Red和核染色
试剂 (DAPI) 并培养，然后用共聚焦荧光显微镜观察。
结果证实DAPI染色的细胞核内 (蓝色)有数个核仁存在。
<染色条件>
・PFA 固定
细胞在4％PFA室温下浸泡5 min，再用Triton X-100在室温下浸泡20 min，加入各种荧光探针后培养5 min。
・MeOH 固定
细胞在冷的MeOH中浸泡1 min，再用Triton X-100在室温下浸泡20 min，加入各种荧光探针后培养5 min。
| <检测条件> |
Nucleolus Bright Green Ex: 488 nm / Em: 500-600 nm
Nucleolus Bright Red Ex: 561 nm / Em: 565-650 nm
DAPI Ex: 405 nm / Em: 450-495 nm
特点2：核仁定位
用4％PFA固定WI-38细胞后，用抗Fibrillarin一抗和荧光标记的二抗免疫染色，并加入Nucleolus Bright Green或Red和核染色试剂
(DAPI) ，培养后，用落射式荧光显微镜 (Keyence，BZ-X710) 观察。
结果证实Nucleolus Bright Green和Nucleolus Bright Red与核仁标记物(Dense Fibrillar Component)的染色部位一致。
＜检测条件＞
Nucleolus Bright Green：Ex: 450-490 nm / Em: 500-550 nm
Nucleolus Bright Red：Ex: 533-548 nm / Em: 570-640 nm
DAPI：Ex: 340-380 nm / Em: 435-485 nm
Anti-Fibrillarin 抗体：Ex: 590-650 nm / Em: 668-733 nm
特点:3：与核仁相关的领域的报告示例
| 相关领域 | 概要 | 文献 | ||
| 评论(衰老） | 关于各种参与细胞功能的核仁， 包括与癌症和早老症的已知关系、 特别是关于衰老的核仁功能。 |
V. Tiku, A. Antebi, “Nucleolar Function in Lifespan Regulation.”, Trends Cell Biol., 2018, 28(8), 662. | ||
| 细胞衰老 | 由于与抑制衰老有关的蛋白质缺损、 核仁数量的减少和核仁总面积的加。 |
H. Tanaka, S. Takebayashi, A. Sakamoto, T. Igata, Y. Nakatsu, N. Saitoh, S. Hino, M. Nakao, “The SETD8/PR-Set7 Methyltransferase Functions as a Barrier to Prevent Senescence-Associated Metabolic Remodeling.”, Cell Rep.,2017, 18(9), 2148. | ||
| 细胞衰老 | 由于rRNA加工因子的枯竭导致 核仁肥大化， 同时SA-βGal和p16表达增加。 |
K. Nishimura, T. Kumazawa, T. Kuroda, N. Katagiri, M. Tsuchiya, N. Goto, R. Furumai, A. Murayama, J. Yanagisawa, K. Kimura, “Perturbation of ribosome biogenesis drives cells into senescence through 5S RNP-mediated p53 activation.”, Cell Rep., 2015, 10(8), 1310. | ||
| 自噬 | 通过抑制RNA聚合酶的转录， 确认自噬的诱导和核仁的形状变化。 |
N. Katagiri, T. Kuroda, H. Kishimoto, Y. Hayashi, T. Kumazawa and K. Kimura, “The nucleolar protein nucleophosmin is essential for autophagy induced by inhibiting Pol I transcription”, Scientific Reports, 2015, 8903, DOI: 10.1038/srep08903. | ||
衰老细胞的评价例
将不同传代数的WI-38细胞用4％ PFA固定后，用PBS洗净并用1％ Triton X-100进行破膜处理，然后加入Nucleolus Bright Green或
Red和核染色试剂 (DAPI)，培养后用共聚焦荧光显微镜观察。
结果证实第3代细胞 (P3) 中的一个细胞核内存在多个核仁，而第18代细胞 (P18) 中核仁变大并成为一体。
<染色条件>
细胞在4％ PFA室温下浸泡5 min，再用Triton X-100在室温下浸泡20 min，加入各种荧光探针后培养5 min。
＜检测条件＞
Nucleolus Bright Green Ex: 488 nm / Em: 500-600 nm
Nucleolus Bright Red Ex: 561 nm / Em: 565-650 nm
DAPI Ex: 405 nm / Em: 450-495 nm
产品实验例
实验例：通过共聚焦定量细胞成像仪进行定量分析
使用共聚焦定量细胞成像仪 (横河电机株式会社 CQ1)对衰老细胞的定量分析。
将传代数不同的WI-38细胞固定后，分别用Nucleolus Bright Green和DAPI染色核仁，并用共聚焦定量细胞成像仪进行定量分析
通过图像对核仁进行分析
用共聚焦定量细胞成像仪在405nm处拍摄细胞核图像，在488nm处拍摄核仁体像，通过分析软件Cell Pathfinder识别各个细胞核内的核仁，并计算出其数量。
横河电机CQ1拍摄条件
使用板：96孔板
物镜：40倍
激发波长：
405nm（DAPI）：蓝色
488nm（Nucleolus Bright Green）：绿色
视野：16视野
<解析图像>
蓝框线：核
红框线：核仁
核仁数分析
在传代数较多的细胞中，得到了1个细胞核中只有1个核仁的比例增加，而2个及以上核仁的比例减少的结果。该结果与下述论文中衰老的WI-38细胞中核仁数的减少(论文中的Table3)*1，以及通过SETD8敲低诱导衰老的细胞核仁的变化(论文中的Figure4D)*2得到了相同的结果。
*1 P. M. Bemiller, L. Lee, “Nucleolar changes in senescing WI-38 cells”, Mech. Ageing Dev., 1978, 8 , 417.
*2 H. Tanaka, S. Takebayashi, A. Sakamoto, T. Igata, Y. Nakatsu, N. Saitoh, S. Hino, M. Nakao, “The SETD8/PR-Set7 Methyltransferase Functions as a Barrier to Prevent Senescence-Associated Metabolic Remodeling.”, Cell Rep., 2017, 18(9), 2148.
荧光特性
常见问题Q&A
| Q1：可以染色活细胞吗？ |
| A1：本试剂建议用于固定细胞染色，不建议用活细胞染色。如果您想用活细胞染色，请联系我们的技术支持。 |
产品文献
1、T. Miki, T. Nakai, M. Hashimoto, K. Kajiwara, H. Tsutsumi and H. Mihara, "Intracellular artificial supramolecules based on de novo designed Y15 peptides", Nat. Comm., 2021, doi:10.1038/s41467-021-23794-6.
2、T. Nozaki and S. Shigenobu, "Ploidy dynamics in aphid host cellsharbor ing bacterial symbionts", Sci. Rep., 2022, doi:10.1038/s41598-022-12836-8.
SAT-3试剂 货号：S302
N,N'-Bis(2-hydroxy-3-sulfopropyl)tolidine, disodium salt, tetrahydrate
CAS号：679787-07-6
商品信息
储存条件：0-5度保存,避光
运输条件：室温
分子式：C20H26N2Na2O8S2･4H2O 分子量：604.62
氧化反应
产品简介
SAT-3是一种稳定的、高水溶性的o-Tolidine (3,3‘-二甲基联 苯胺)类似物。它很容易在过氧化物酶和过氧化氢酶存在下，被氧化为绿色的显色底物(pH 4~6)。
TMBZ需要有有机溶剂和表面活性剂才可以溶解，而SAT-3仅用缓冲液即可溶剂。并且，SAT-3溶液只需要常温避光即可保存。本试剂的最大波长在675 nm处。
操作步骤
1. 将1 ml的100 mM SAT-3 solution加至含有30 mM过氧化氢酶溶液的8 ml的50 mM citrate缓冲液(pH 4)中，制成assay solution。
2. 向96孔板的每孔中加入100-200 μl assay solution，37℃培养5-30 min。
3. 检测670 nm处吸光度或者每孔加入50 μl的4 M硫酸，检测490 nm处吸光度。
参考文献
1) M. Mizoguchi, M. Ishiyama, M. Shiga and K. Sasamoto, "Sensitive Chromogenic Substrate for Detecting Peroxidase Activity", Anal. Commun, 1998, 35, 179.
操作和储存条件
规格
性状：白色至浅棕色粉末
纯度(HPLC)：≥95.0%
水中溶解度：通过检测(透明，无色至微蓝色)
pH(25℃)：6.0~8.0 (25℃)
含水量：9.0~14.0%
IR谱图：一致
操作和储存条件
0-5℃，避光
TMBZ试剂 货号：T022
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine
CAS号：54827-17-7
商品信息
储存条件：室温，避光，防潮，避金属
运输条件：室温
分子式：C16H20N2 分子量：240.34
产品概述
TMBZ是一种用于过氧化物酶检测的生色试剂。它已被开发作为具有致癌性的联 苯胺的一种替代品。由于其苯环上的邻位甲基，TMBZ不会代谢成高致癌的ο-羟基联 苯胺或ο,ο'-二羟基联 苯胺。因此TMBZ化合物的致癌性远小于联 苯胺。尽管TMBZ溶液无色，但在过氧化氢和过氧化物酶存在的情况下，它会变为蓝绿色 (最大波长：655 nm) 。此蓝绿色的复合物的结构被认为是两个氧化的TMBZ分子的自由基形式。TMBZ HCl是TMBZ的盐酸化物形式，它可溶于水 (每10 ml水溶解100 mg TMBZ HCl) 。
检测步骤
检测步骤
1. 用1 ml DMSO溶解6 mg TMBZ以制备100×TMBZ溶液。
2. 将5μl 30%的过氧化氢溶液与1 ml PBS混合以制备200×H2O2溶液。
3. 向1 ml PBS中加入10μl 100×TMBZ溶液和5μl 200×H2O2溶液以制备染色溶液。*
4. 向96孔板的每孔中加入100-200μl染色溶液。室温或37℃下孵育该板5 min-1 h。
5. 用PBS洗涤样品若干次以终止染色反应。
* 为得到最佳结果，可能有必要对TMBZ和过氧化氢的最终浓度作修改。染色溶液并不稳定。请在使用前制备新鲜溶液。
氧化反应
参考文献
1) V. R. Holland, B. C. Saunders, F. L. Rose and A. L. Walpole, "A Safer Substitute for Benzidine in the Detection of Blood", Tetrahedron, 1974, 30, 3299.
2) W. Levin, D. Ryan, S. West and A. Y. H Lu, "Preparation of Partially Purified, Lipid-depleted Cytochrome P-450 and Reduced Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate-cytochrome c Reductase from Rat Liver Microsomes", J. Biol. Chem., 1974, 249, 1747.
3) P. E. Thomas, D. Ryan and W. Levin, "An Improved Staining Procedure for the Detection of the Peroxidase Activity of Cytochrome p-450 on Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gels", Anal. Biochem., 1976, 75, 168.
4) H. H. Liem, F. Cardenas, M. Tavassoli, M. B. Poh-Fitzpatrick and U. Muller-Eberhard, "Quantitative Determination of Hemoglobin and Cytochemical Staining for Peroxidase Using 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride, a Safe Substitute for Benzidine", Anal. Biochem., 1979, 98, 388.
5) R. C. Lijana and M. C. Williams, "Tetramethylbenzidine- A substitute for Benzidine in Hemoglobin Analysis", J. Lab. Clin. Med., 1979, 94, 266.
6) R. M. Jaffe and W. Zierdt, "A New Occult Blood Test Not Subject to False-Negative Results from Reducing Substances", J. Lab. Clin. Med., 1979, 93, 879.
7) 吉野二男, "還元剤によっても偽陰性を示さない新しい潜血反応試薬", 臨床検査, 1980, 24, 140.
8) K. Suzuki, H. Ota, S. Sasagawa, T. Sakatani and T. Fujikura, "Assay Method for Myeloperoxidase in Human Polymorphonuclear Leukocytes", Anal. Biochem., 1983, 132, 345.
9) 鈴木和男, 笹川澄子, 坂谷達一郎, 太田洋美, 大西寿, 藤倉敏夫, "自動マルチウェルリーダーを用いた酵素活性の高感度レートアッセイ法 -多形核白血球ミエロパーオキシデースをモデルとして", 医学のあゆみ, 1984, 131, 163.
10) F. H. Pujol, I. Rodriguez, M. Devesa, R. Rangel-Aldao and F. Liprandi, "A Double Sandwich Monoclonal Enzyme Immunoassay for Detection of Hepatitis B Surface Antigen", J. Immunol., 1993, 14, 21.
11) F. B. Serrat, "Colorimetric Method for Determiantion of Chlorine with 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine", Talanta, 1994, 41, 2091.
TMBZ･HCl试剂 货号：T039
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine, dihydrochloride, dihydrate
CAS号：207738-08-7
商品信息
储存条件：室温，避光，防潮，避金属
运输条件：室温
分子式：
ADOS试剂 货号：OC01
N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline, sodium salt, dihydrate
CAS号：82692-96-4（无水物）
商品信息
储存条件：室温，避光防潮
运输条件：室温
分子式：C12H18NNaO5S･2H2O 分子量：347.36
产品概述
新型Trinder's试剂是Dojindo最 先开发的一种基于氧化的显色试剂，是一种高水溶性苯胺衍生物，常用作诊断试剂色原。在比色法测定过氧化氢活性中比常规生色的试剂具有若干优势。Dojindo的色原纯度高，稳定性好，既可以用于溶液也可以用于试验流水线检测系统中。在过氧化氢和过氧化物酶的存在下，色原在与4-氨基安替比林 (4-AA) 或3-甲基苯并噻唑砜腙(MBTH) 的氧化偶合反应过程中，形成非常稳定的紫色或蓝色染料。与MBTH偶合染料的摩尔吸光度比与4-AA偶合染料的高1.5-2倍，然而4-AA溶液比MBTH溶液更稳定。底物被其氧化酶酶促氧化产生过氧化氢。该过氧化氢的浓度对应于底物浓度。因此可通过氧化偶合反应的显色测定底物的量。葡萄糖、酒精、酰基-辅酶A和胆固醇可以用于检测与色原及4-AA偶合的那些底物。现有10种色原。 对于特定的底物，试验不同种类的色原对开发最佳的检测系统是必需的。
产品特征描述
新型Trinder's试剂的特征描述
以上摩尔吸光系数为各种Trinder's试剂在H2O2/POD催化下，与4-AA在37℃，反应10分钟生成的产物，
在各自的最大检测波长处以及合适的pH范围内检测得到的。
反应原理
氧化反应
参考文献
1. K. Tamaoku, et al., New water-soluble Hydrogen Donors for the Enzymatic Photometric Determination of Hydrogen Peroxide. II. N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)aniline derivatives. Chem Pharm Bull. 1982;30:2492-2497.
2. K. Tamaoku, et al., New water-soluble Hydrogen Donors for the Enzymatic Spectrophotometric Determination of Hydrogen Peroxide. Anal Chim Acta. 1982;136:121-127.
3. B. C. Madsen, et al., Flow Injection and Photometric Determination of Hydrogen Peroxide in Rainwater with N-Ethyl-N-(sulfopropyl)aniline sodium salt. Anal Chem. 1984;56:2849-2850.
ADPS试剂 货号：OC02
N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline, sodium salt, monohydrate
CAS号：82611-88-9（无水物）
商品信息
储存条件：室温，避光防潮
运输条件：室温
分子式：
C12H18NNaO4S･H2O 分子量：313.35
产品概述
新型Trinder's试剂是Dojindo最 先开发的一种基于氧化的显色试剂，是一种高水溶性苯胺衍生物，常用作诊断试剂色原。在比色法测定过氧化氢活性中比常规生色的试剂具有若干优势。Dojindo的色原纯度高，稳定性好，既可以用于溶液也可以用于试验流水线检测系统中。在过氧化氢和过氧化物酶的存在下，色原在与4-氨基安替比林 (4-AA) 或3-甲基苯并噻唑砜腙(MBTH) 的氧化偶合反应过程中，形成非常稳定的紫色或蓝色染料。与MBTH偶合染料的摩尔吸光度比与4-AA偶合染料的高1.5-2倍，然而4-AA溶液比MBTH溶液更稳定。底物被其氧化酶酶促氧化产生过氧化氢。该过氧化氢的浓度对应于底物浓度。因此可通过氧化偶合反应的显色测定底物的量。葡萄糖、酒精、酰基-辅酶A和胆固醇可以用于检测与色原及4-AA偶合的那些底物。现有10种色原。 对于特定的底物，试验不同种类的色原对开发最佳的检测系统是必需的。
产品特征描述
新型Trinder's试剂的特征描述
以上摩尔吸光系数为各种Trinder's试剂在H2O2/POD催化下，与4-AA在37℃，反应10分钟生成的产物，
在各自的最大检测波长处以及合适的pH范围内检测得到的。
反应原理
氧化反应
参考文献
1. K. Tamaoku, et al., New water-soluble Hydrogen Donors for the Enzymatic Photometric Determination of Hydrogen Peroxide. II. N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)aniline derivatives. Chem Pharm Bull. 1982;30:2492-2497.
2. K. Tamaoku, et al., New water-soluble Hydrogen Donors for the Enzymatic Spectrophotometric Determination of Hydrogen Peroxide. Anal Chim Acta. 1982;136:121-127.
3. B. C. Madsen, et al., Flow Injection and Photometric Determination of Hydrogen Peroxide in Rainwater with N-Ethyl-N-(sulfopropyl)aniline sodium salt. Anal Chem. 1984;56:2849-2850.
DAOS试剂 货号：OC06
N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline, sodium salt
CAS号：83777-30-4
商品信息
储存条件：室温，避光防潮
运输条件：室温
分子式：C13H20NNaO6S 分子量：341.36
产品概述
新型Trinder's试剂是Dojindo最 先开发的一种基于氧化的显色试剂，是一种高水溶性苯胺衍生物，常用作诊断试剂色原。在比色法测定过氧化氢活性中比常规生色的试剂具有若干优势。Dojindo的色原纯度高，稳定性好，既可以用于溶液也可以用于试验流水线检测系统中。在过氧化氢和过氧化物酶的存在下，色原在与4-氨基安替比林 (4-AA) 或3-甲基苯并噻唑砜腙(MBTH) 的氧化偶合反应过程中，形成非常稳定的紫色或蓝色染料。与MBTH偶合染料的摩尔吸光度比与4-AA偶合染料的高1.5-2倍，然而4-AA溶液比MBTH溶液更稳定。底物被其氧化酶酶促氧化产生过氧化氢。该过氧化氢的浓度对应于底物浓度。因此可通过氧化偶合反应的显色测定底物的量。葡萄糖、酒精、酰基-辅酶A和胆固醇可以用于检测与色原及4-AA偶合的那些底物。现有10种色原。 对于特定的底物，试验不同种类的色原对开发最佳的检测系统是必需的。
产品特征描述
新型Trinder's试剂的特征描述
以上摩尔吸光系数为各种Trinder's试剂在H2O2/POD催化下，与4-AA在37℃，反应10分钟生成的产物，
在各自的最大检测波长处以及合适的pH范围内检测得到的。
反应原理
氧化反应
参考文献
1. K. Tamaoku, et al., New water-soluble Hydrogen Donors for the Enzymatic Photometric Determination of Hydrogen Peroxide. II. N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)aniline derivatives. Chem Pharm Bull. 1982;30:2492-2497.
2. K. Tamaoku, et al., New water-soluble Hydrogen Donors for the Enzymatic Spectrophotometric Determination of Hydrogen Peroxide. Anal Chim Acta. 1982;136:121-127.
3. B. C. Madsen, et al., Flow Injection and Photometric Determination of Hydrogen Peroxide in Rainwater with N-Ethyl-N-(sulfopropyl)aniline sodium salt. Anal Chem. 1984;56:2849-2850.
HDAOS试剂 货号：OC08
N-(2-Hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline, sodium salt
CAS号：82692-88-4
商品信息
储存条件：室温，避光防潮
运输条件：室温
分子式：C11H16NNaO6S 分子量：313.3
产品概述
新型Trinder's试剂是Dojindo最 先开发的一种基于氧化的显色试剂，是一种高水溶性苯胺衍生物，常用作诊断试剂色原。在比色法测定过氧化氢活性中比常规生色的试剂具有若干优势。Dojindo的色原纯度高，稳定性好，既可以用于溶液也可以用于试验流水线检测系统中。在过氧化氢和过氧化物酶的存在下，色原在与4-氨基安替比林 (4-AA) 或3-甲基苯并噻唑砜腙(MBTH) 的氧化偶合反应过程中，形成非常稳定的紫色或蓝色染料。与MBTH偶合染料的摩尔吸光度比与4-AA偶合染料的高1.5-2倍，然而4-AA溶液比MBTH溶液更稳定。底物被其氧化酶酶促氧化产生过氧化氢。该过氧化氢的浓度对应于底物浓度。因此可通过氧化偶合反应的显色测定底物的量。葡萄糖、酒精、酰基-辅酶A和胆固醇可以用于检测与色原及4-AA偶合的那些底物。现有10种色原。 对于特定的底物，试验不同种类的色原对开发最佳的检测系统是必需的。
产品特征描述
新型Trinder's试剂的特征描述
以上摩尔吸光系数为各种Trinder's试剂在H2O2/POD催化下，与4-AA在37℃，反应10分钟生成的产物，
在各自的最大检测波长处以及合适的pH范围内检测得到的。
反应原理
氧化反应
参考文献
1. K. Tamaoku, et al., New water-soluble Hydrogen Donors for the Enzymatic Photometric Determination of Hydrogen Peroxide. II. N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)aniline derivatives. Chem Pharm Bull. 1982;30:2492-2497.
2. K. Tamaoku, et al., New water-soluble Hydrogen Donors for the Enzymatic Spectrophotometric Determination of Hydrogen Peroxide. Anal Chim Acta. 1982;136:121-127.
3. B. C. Madsen, et al., Flow Injection and Photometric Determination of Hydrogen Peroxide in Rainwater with N-Ethyl-N-(sulfopropyl)aniline sodium salt. Anal Chem. 1984;56:2849-2850.
MAOS试剂 货号：OC11
N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylaniline, sodium salt, monohydrate
CAS号：82692-97-5（无水物）
商品信息
储存条件：室温，避光防潮
运输条件：室温
分子式：C13H20NNaO4S･H2O 分子量：327.37
产品概述
新型Trinder's试剂是Dojindo最 先开发的一种基于氧化的显色试剂，是一种高水溶性苯胺衍生物，常用作诊断试剂色原。在比色法测定过氧化氢活性中比常规生色的试剂具有若干优势。Dojindo的色原纯度高，稳定性好，既可以用于溶液也可以用于试验流水线检测系统中。在过氧化氢和过氧化物酶的存在下，色原在与4-氨基安替比林 (4-AA) 或3-甲基苯并噻唑砜腙(MBTH) 的氧化偶合反应过程中，形成非常稳定的紫色或蓝色染料。与MBTH偶合染料的摩尔吸光度比与4-AA偶合染料的高1.5-2倍，然而4-AA溶液比MBTH溶液更稳定。底物被其氧化酶酶促氧化产生过氧化氢。该过氧化氢的浓度对应于底物浓度。因此可通过氧化偶合反应的显色测定底物的量。葡萄糖、酒精、酰基-辅酶A和胆固醇可以用于检测与色原及4-AA偶合的那些底物。现有10种色原。 对于特定的底物，试验不同种类的色原对开发最佳的检测系统是必需的。
产品特征描述
新型Trinder's试剂的特征描述
以上摩尔吸光系数为各种Trinder's试剂在H2O2/POD催化下，与4-AA在37℃，反应10分钟生成的产物，
在各自的最大检测波长处以及合适的pH范围内检测得到的。
反应原理
氧化反应
参考文献
1. K. Tamaoku, et al., New water-soluble Hydrogen Donors for the Enzymatic Photometric Determination of Hydrogen Peroxide. II. N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)aniline derivatives. Chem Pharm Bull. 1982;30:2492-2497.
2. K. Tamaoku, et al., New water-soluble Hydrogen Donors for the Enzymatic Spectrophotometric Determination of Hydrogen Peroxide. Anal Chim Acta. 1982;136:121-127.
3. B. C. Madsen, et al., Flow Injection and Photometric Determination of Hydrogen Peroxide in Rainwater with N-Ethyl-N-(sulfopropyl)aniline sodium salt. Anal Chem. 1984;56:2849-2850.
TOOS试剂 货号：OC13
N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline, sodium salt, dihydrate
CAS号：82692-93-1（无水物）
商品信息
储存条件：室温，避光防潮
运输条件：室温
分子式：C12H18NNaO4S･2H2O 分子量：331.36
产品概述
新型Trinder's试剂是Dojindo最 先开发的一种基于氧化的显色试剂，是一种高水溶性苯胺衍生物，常用作诊断试剂色原。在比色法测定过氧化氢活性中比常规生色的试剂具有若干优势。Dojindo的色原纯度高，稳定性好，既可以用于溶液也可以用于试验流水线检测系统中。在过氧化氢和过氧化物酶的存在下，色原在与4-氨基安替比林 (4-AA) 或3-甲基苯并噻唑砜腙(MBTH) 的氧化偶合反应过程中，形成非常稳定的紫色或蓝色染料。与MBTH偶合染料的摩尔吸光度比与4-AA偶合染料的高1.5-2倍，然而4-AA溶液比MBTH溶液更稳定。底物被其氧化酶酶促氧化产生过氧化氢。该过氧化氢的浓度对应于底物浓度。因此可通过氧化偶合反应的显色测定底物的量。葡萄糖、酒精、酰基-辅酶A和胆固醇可以用于检测与色原及4-AA偶合的那些底物。现有10种色原。 对于特定的底物，试验不同种类的色原对开发最佳的检测系统是必需的。
产品特征描述
新型Trinder's试剂的特征描述
以上摩尔吸光系数为各种Trinder's试剂在H2O2/POD催化下，与4-AA在37℃，反应10分钟生成的产物，
在各自的最大检测波长处以及合适的pH范围内检测得到的。
反应原理
氧化反应
参考文献
1. K. Tamaoku, et al., New water-soluble Hydrogen Donors for the Enzymatic Photometric Determination of Hydrogen Peroxide. II. N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)aniline derivatives. Chem Pharm Bull. 1982;30:2492-2497.
2. K. Tamaoku, et al., New water-soluble Hydrogen Donors for the Enzymatic Spectrophotometric Determination of Hydrogen Peroxide. Anal Chim Acta. 1982;136:121-127.
3. B. C. Madsen, et al., Flow Injection and Photometric Determination of Hydrogen Peroxide in Rainwater with N-Ethyl-N-(sulfopropyl)aniline sodium salt. Anal Chem. 1984;56:2849-2850.
TOPS试剂 货号：OC14
N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methylaniline, sodium salt, monohydrate
CAS号：40567-80-4（无水物）
商品信息
储存条件：0-5度保存，避光防潮
运输条件：室温
分子式：C12H18NNaO3S･H2O 分子量：297.34
产品特征描述
新型Trinder's试剂是Dojindo最 先开发的一种基于氧化的显色试剂，是一种高水溶性苯胺衍生物，常用作诊断试剂色原。在比色法测定过氧化氢活性中比常规生色的试剂具有若干优势。Dojindo的色原纯度高，稳定性好，既可以用于溶液也可以用于试验流水线检测系统中。在过氧化氢和过氧化物酶的存在下，色原在与4-氨基安替比林 (4-AA) 或3-甲基苯并噻唑砜腙(MBTH) 的氧化偶合反应过程中，形成非常稳定的紫色或蓝色染料。与MBTH偶合染料的摩尔吸光度比与4-AA偶合染料的高1.5-2倍，然而4-AA溶液比MBTH溶液更稳定。底物被其氧化酶酶促氧化产生过氧化氢。该过氧化氢的浓度对应于底物浓度。因此可通过氧化偶合反应的显色测定底物的量。葡萄糖、酒精、酰基-辅酶A和胆固醇可以用于检测与色原及4-AA偶合的那些底物。现有10种色原。 对于特定的底物，试验不同种类的色原对开发最佳的检测系统是必需的。
产品特征描述
新型Trinder's试剂的特征描述
以上摩尔吸光系数为各种Trinder's试剂在H2O2/POD催化下，与4-AA在37℃，反应10分钟生成的产物，
在各自的最大检测波长处以及合适的pH范围内检测得到的。
反应原理
氧化反应
参考文献
1. K. Tamaoku, et al., New water-soluble Hydrogen Donors for the Enzymatic Photometric Determination of Hydrogen Peroxide. II. N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)aniline derivatives. Chem Pharm Bull. 1982;30:2492-2497.
2. K. Tamaoku, et al., New water-soluble Hydrogen Donors for the Enzymatic Spectrophotometric Determination of Hydrogen Peroxide. Anal Chim Acta. 1982;136:121-127.
3. B. C. Madsen, et al., Flow Injection and Photometric Determination of Hydrogen Peroxide in Rainwater with N-Ethyl-N-(sulfopropyl)aniline sodium salt. Anal Chem. 1984;56:2849-2850.
MADB试剂 货号：OC21
N,N-Bis(4-sulfobutyl)-3,5-dimethylaniline, disodium salt
CAS号：209518-16-1
商品信息
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温
分子式：C16H25NNa2O6S2 分子量：437.48
产品概述
新型Trinder's试剂是Dojindo最 先开发的一种基于氧化的显色试剂，是一种高水溶性苯胺衍生物，常用作诊断试剂色原。在比色法测定过氧化氢活性中比常规生色的试剂具有若干优势。Dojindo的色原纯度高，稳定性好，既可以用于溶液也可以用于试验流水线检测系统中。在过氧化氢和过氧化物酶的存在下，色原在与4-氨基安替比林 (4-AA) 或3-甲基苯并噻唑砜腙(MBTH) 的氧化偶合反应过程中，形成非常稳定的紫色或蓝色染料。与MBTH偶合染料的摩尔吸光度比与4-AA偶合染料的高1.5-2倍，然而4-AA溶液比MBTH溶液更稳定。底物被其氧化酶酶促氧化产生过氧化氢。该过氧化氢的浓度对应于底物浓度。因此可通过氧化偶合反应的显色测定底物的量。葡萄糖、酒精、酰基-辅酶A和胆固醇可以用于检测与色原及4-AA偶合的那些底物。现有10种色原。 对于特定的底物，试验不同种类的色原对开发最佳的检测系统是必需的。
产品特征描述
新型Trinder's试剂的特征描述
以上摩尔吸光系数为各种Trinder's试剂在H2O2/POD催化下，与4-AA在37℃，反应10分钟生成的产物，
在各自的最大检测波长处以及合适的pH范围内检测得到的。
反应原理
氧化反应
参考文献
1. K. Tamaoku, et al., New water-soluble Hydrogen Donors for the Enzymatic Photometric Determination of Hydrogen Peroxide. II. N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)aniline derivatives. Chem Pharm Bull. 1982;30:2492-2497.
2. K. Tamaoku, et al., New water-soluble Hydrogen Donors for the Enzymatic Spectrophotometric Determination of Hydrogen Peroxide. Anal Chim Acta. 1982;136:121-127.
3. B. C. Madsen, et al., Flow Injection and Photometric Determination of Hydrogen Peroxide in Rainwater with N-Ethyl-N-(sulfopropyl)aniline sodium salt. Anal Chem. 1984;56:2849-2850.
TODB试剂 货号：OC22
N,N-Bis(4-sulfobutyl)-3-methylaniline, disodium salt
CAS号：1044537-70-3
商品信息
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温
分子式：C15H23NNa2S2O6 分子量：423.46
产品概述
新型Trinder's试剂是Dojindo最 先开发的一种基于氧化的显色试剂，是一种高水溶性苯胺衍生物，常用作诊断试剂色原。在比色法测定过氧化氢活性中比常规生色的试剂具有若干优势。Dojindo的色原纯度高，稳定性好，既可以用于溶液也可以用于试验流水线检测系统中。在过氧化氢和过氧化物酶的存在下，色原在与4-氨基安替比林 (4-AA) 或3-甲基苯并噻唑砜腙(MBTH) 的氧化偶合反应过程中，形成非常稳定的紫色或蓝色染料。与MBTH偶合染料的摩尔吸光度比与4-AA偶合染料的高1.5-2倍，然而4-AA溶液比MBTH溶液更稳定。底物被其氧化酶酶促氧化产生过氧化氢。该过氧化氢的浓度对应于底物浓度。因此可通过氧化偶合反应的显色测定底物的量。葡萄糖、酒精、酰基-辅酶A和胆固醇可以用于检测与色原及4-AA偶合的那些底物。现有10种色原。 对于特定的底物，试验不同种类的色原对开发最佳的检测系统是必需的。
产品特征描述
新型Trinder's试剂的特征描述
以上摩尔吸光系数为各种Trinder's试剂在H2O2/POD催化下，与4-AA在37℃，反应10分钟生成的产物，
在各自的最大检测波长处以及合适的pH范围内检测得到的。
反应原理
氧化反应
参考文献
1. K. Tamaoku, et al., New water-soluble Hydrogen Donors for the Enzymatic Photometric Determination of Hydrogen Peroxide. II. N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)aniline derivatives. Chem Pharm Bull. 1982;30:2492-2497.
2. K. Tamaoku, et al., New water-soluble Hydrogen Donors for the Enzymatic Spectrophotometric Determination of Hydrogen Peroxide. Anal Chim Acta. 1982;136:121-127.
3. B. C. Madsen, et al., Flow Injection and Photometric Determination of Hydrogen Peroxide in Rainwater with N-Ethyl-N-(sulfopropyl)aniline sodium salt. Anal Chem. 1984;56:2849-2850.
WST-1试剂 货号：W201
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt
CAS号：150849-52-8
商品信息
储存条件：0-5度保存，避光
运输条件：室温
分子式：C19H11IN5NaO8S2 分子量：651.35
产品详情
外观：浅黄棕色粉末
纯度：通过检测 (TLC)
反应式
WSTs产品说明
水溶性四唑盐 (WST®) 是通过向四唑盐的苯环中引入正电荷或负电荷以及羟基而产生的，三烷基氨基等正电荷改进了甲臜染料的水溶性，然而大的阳离子容易与羧酸根或磷酸根等有机阴离子沉淀出来。尽管羟基也会增进四唑盐的水溶性，但所产生的甲臜染料的水溶性并不足。Dojindo的WST®具有磺酸基，它们直接或间接地加入苯环以增进水溶性。Dojindo还提供几种新开发的苯偶氮型四唑盐，它可被NADH或其他还原剂轻易地还原得到橙色或紫色的甲臜染料。由于采用苯偶氮基团，颜色会随重金属离子而改变。由于Dojindo的WST®水溶性较高，因此可以制备10 mM-100 mM不同浓度的溶液。
电子转移到四唑盐的机制
技术信息
图2.WST甲臜染料的吸收光谱
参考文献
1) M. Ishiyama, M. Shiga, K. Sakamoto, M. Mizoguchi and Pin-Gang He, "A New Sulfonated Tetrazolium Salt That produces a Highly Water-soluble Formazan Dye", Chem. Pharm. Bull., 1993, 41, 1118.
2) T. Yano, K. Teruya, S. Shirahata, J. Watanabe, K. Osada, H. Tachibana, H. Ohashi, Eun-Ho Kim and H. Murakami, "Ras Oncogene Enhances the Production of a Recombinant Protein Regulated by the Cytomegalovirus Promoter in BHK-21 Cells", Cytotechnology, 1994, 16, 167.
3) K. Teruya, T. Yano, S. Shirahata, J. Watanabe, K. Osada, H. Ohashi, H. Tachibana, Eun-Ho Kim and H. Murakami, "Ras Amplification in BHK-21 Cells Produces a Host Cell Line for Further Rapid Establishment of Recombiant Protein Hyper-producing Cell Lines", Biosci. Biotech. Biochem., 1995, 59, 341.
4) M. Ishiyama, K. Sasamoto, M. Shiga, Y. Ohkura and K. Ueno, "Novel Disulfonated Tetrazolium Salt That can be Reduced to a Water-soluble Formazan and Its Application to the Assay of Lactate Dehydrogenase", Analyst, 1995, 120, 113.
5) M. Ishiyama, H. Tominaga, M. Shiga, K. Sasamoto, Y. Ohkura, K. Ueno and M. Watanabe, "Novel Cell Proliferation and Cytotoxicity Assays Using a Tetrazolium Salt That Produces a Water-soluble Formazan Dye", In Vitro Toxicology, 1995, 8, 187.
6) S. Q. Liu, K. Saijo, T. Todoroki and T. Ohno, "Induction of Human Autologous Cytotoxic T Lymphocytes on Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tumour Sections", Nature Med., 1995, 1(3), 267.
7) T. Takenouchi and E. Munekata, "Trophic Effects of Substance P and β-Amyloid Peptide on Dibutyryl Cyclic AMP-Differentiated Human Leukemic (HL-60) Cells", Life Sci., 1995, 56, 479.
8) T. Iwaki, A. Iwaki, Y. Fukumaki and J. Tateishi, "β-Crystallin in C6 Glioma Cells Supports their Survival in Elevated Extracellular K+: the Implication of a Protective Role of β-Crystallin Accumulation in Reactive Glia", Brain Res., 1995, 673, 47.
9) M. Ishiyama, H. Tominaga, M. Shiga, K. Sasamoto, Y. Ohkura and K. Ueno, "A Combined Assay of Cell Viability and vitro Cytotoxycity with a Highly Water-soluble Tetrazolium Salt, Neutral Red and Crystal Violet", Biol. Pharm. Bul., 1996, 19, 1518.
10) T. Mosmann, "Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays", J. Immunol. Methods, 1983, 65, 55.
11) A. H. Cory, T. C. Owen, J. A. Barltrop and J. G. Cory, "Use of an Aqueous Soluble Tetrazolium/Formazan Assay for Cell Growth Assays in Culture", Cancer Commun., 1991, 3, 207.
12) N. W. Roehm, G. H. Rodgers, S. M. Hatfield and A. L. Glasebrook, "An Improved Colorimetric Assay for Cell Proliferation and Viability Utilizing the Tetrazolium Salt XTT", J. Immunol. Methods, 1991, 142, 257.
WST-3试剂 货号：W202
2-(4-Iodophenyl)-3-(2,4-dinitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt
CAS号：515111-36-1
商品信息
储存条件：0-5度保存，避光
运输条件：室温
分子式：C19H10IN6NaO10S2 分子量：696.34
产品详情
外观：浅黄棕色或浅棕色粉末
纯度：通过检测 (TLC)
反应式
WSTs产品说明
水溶性四唑盐 (WST®) 是通过向四唑盐的苯环中引入正电荷或负电荷以及羟基而产生的，三烷基氨基等正电荷改进了甲臜染料的水溶性，然而大的阳离子容易与羧酸根或磷酸根等有机阴离子沉淀出来。尽管羟基也会增进四唑盐的水溶性，但所产生的甲臜染料的水溶性并不足。Dojindo的WST®具有磺酸基，它们直接或间接地加入苯环以增进水溶性。Dojindo还提供几种新开发的苯偶氮型四唑盐，它可被NADH或其他还原剂轻易地还原得到橙色或紫色的甲臜染料。由于采用苯偶氮基团，颜色会随重金属离子而改变。由于Dojindo的WST®水溶性较高，因此可以制备10 mM-100 mM不同浓度的溶液。
电子转移到四唑盐的机制
技术信息
图2.WST甲臜染料的吸收光谱
参考文献
1) M. Ishiyama, K. Sasamoto, M. Shiga, Y. Ohkura, K. Ueno, K. Nishiyama and I. Taniguchi, "Novel Disulfonated Tetrazolium Salt That Can Be Reduced to a Water-soluble Formazan and Its Application to the Assay of Lactate Dehydrogenase", Analyst, 1995, 120, 113.
2) I. Sakurabayashi, T. Watano, S. Yonehara, K. Ishimaru, K. Hirai, T. Komori and M. Yagi, "New Enzymatic Assay for Glycohemoglobin", Clin. Chem., 2003, 49, 269.
WST-4试剂 货号：W203
2-Benzothiazolyl-3-(4-carboxy-2-methoxyphenyl)-5-[4-(2-sulfoethylcarbamoyl)phenyl]-2H-tetrazolium
CAS号：178925-54-7
商品信息
储存条件：0-5度保存，避光
运输条件：室温
分子式：C25H20N6O7S2 分子量：580.59
产品详情
外观：黄色或棕色粉末
纯度：通过检测 (TLC)
反应式
WSTs产品说明
水溶性四唑盐 (WST®) 是通过向四唑盐的苯环中引入正电荷或负电荷以及羟基而产生的，三烷基氨基等正电荷改进了甲臜染料的水溶性，然而大的阳离子容易与羧酸根或磷酸根等有机阴离子沉淀出来。尽管羟基也会增进四唑盐的水溶性，但所产生的甲臜染料的水溶性并不足。Dojindo的WST®具有磺酸基，它们直接或间接地加入苯环以增进水溶性。Dojindo还提供几种新开发的苯偶氮型四唑盐，它可被NADH或其他还原剂轻易地还原得到橙色或紫色的甲臜染料。由于采用苯偶氮基团，颜色会随重金属离子而改变。由于Dojindo的WST®水溶性较高，因此可以制备10 mM-100 mM不同浓度的溶液。
电子转移到四唑盐的机制
技术信息
图2.WST甲臜染料的吸收光谱
参考文献
1) M. Ishiyama, et al., Anal. Sci., 12, 515 (1996).
WST-5试剂 货号：W204
2,2'-Dibenzothiazolyl-5,5'-bis[4-di(2-sulfoethyl)carbamoylphenyl]-3,3'-(3,3'-dimethoxy 4,4'-biphenylene)ditetrazolium, disodium salt
CAS号：178925-55-8
商品信息
储存条件：0-5度保存，避光
运输条件：室温
分子式：C52H44N12Na2O16S6 分子量：1331.35
产品详情
外观：黄色或浅棕绿色粉末
纯度：通过检测 (TLC)
反应式
WSTs产品说明
水溶性四唑盐 (WST®) 是通过向四唑盐的苯环中引入正电荷或负电荷以及羟基而产生的，三烷基氨基等正电荷改进了甲臜染料的水溶性，然而大的阳离子容易与羧酸根或磷酸根等有机阴离子沉淀出来。尽管羟基也会增进四唑盐的水溶性，但所产生的甲臜染料的水溶性并不足。Dojindo的WST®具有磺酸基，它们直接或间接地加入苯环以增进水溶性。Dojindo还提供几种新开发的苯偶氮型四唑盐，它可被NADH或其他还原剂轻易地还原得到橙色或紫色的甲臜染料。由于采用苯偶氮基团，颜色会随重金属离子而改变。由于Dojindo的WST®水溶性较高，因此可以制备10 mM-100 mM不同浓度的溶液。
电子转移到四唑盐的机制
技术信息
图2.WST甲臜染料的吸收光谱
参考文献
1) M. Ishiyama, et al., Anal. Sci., 12, 515 (1996).
WST-9试剂 货号：W217
2-(4-Nitrophenyl)-5-phenyl-3-[4-(4-sulfophenylazo)-2-sulfophenyl]-2H-tetrazolium, monosodium salt
WST-9
商品信息
储存条件：0-5度保存，避光
运输条件：室温
分子式：C25H16N7NaO8S2 分子量：629.56
产品详情
外观：橙色或橙棕色粉末
纯度：通过检测 (TLC)
摩尔吸光度(pH8)：≥24,000 (320 nm左右)
反应式
WSTs产品说明
水溶性四唑盐 (WST®) 是通过向四唑盐的苯环中引入正电荷或负电荷以及羟基而产生的，三烷基氨基等正电荷改进了甲臜染料的水溶性，然而大的阳离子容易与羧酸根或磷酸根等有机阴离子沉淀出来。尽管羟基也会增进四唑盐的水溶性，但所产生的甲臜染料的水溶性并不足。Dojindo的WST®具有磺酸基，它们直接或间接地加入苯环以增进水溶性。Dojindo还提供几种新开发的苯偶氮型四唑盐，它可被NADH或其他还原剂轻易地还原得到橙色或紫色的甲臜染料。由于采用苯偶氮基团，颜色会随重金属离子而改变。由于Dojindo的WST®水溶性较高，因此可以制备10 mM-100 mM不同浓度的溶液。
电子转移到四唑盐的机制
技术信息
图2.WST甲臜染料的吸收光谱
参考文献
1) WST-1: M. Ishiyama, et al., Chem. Pharm. Bull, 41, 1118 (1993),
2) M. Ishiyama, et al., In Vitro Toxicol, 8, 187 (1995),
3) S. Shirahata, et al., Biosci. Biotech. Biochem., 59, 345 (1995),
4) K. Teruya, et al., Biosci. Biotech. Biochem., 59, 341 (1995),
5) Y. Kayamori, et al., Clin. Biochem., 30, 595 (1997);
6) W. Zhang, et al., FASEB J., 20, 2496 (2006);
7) S. Yang, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 319, 595 (2006);
8) D. Inokuma, et al., Stem Cells, 24, 2810 (2006);
9) T. Ishikawa, et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 26, 1998 (2006).
Nitro-TB试剂 货号：N011
3,3'-[3,3'-Dimethoxy-(1,1'-biphenyl)-4,4'-diyl]-bis[2-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride]
CAS号：29 8-83-9
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C40H30Cl2N10O6 分子量：817.64
产品描述
Nitro-TB可被热水或热的甲醇溶解，丙 酮和醚等有机溶剂不能溶解Nitro-TB。Nitro-TB可容易地被脱氢酶还原成紫色甲臜染料凝聚物，它可用于在琼脂糖凝胶上检测脱氢酶。
反应式
产品详情
外观：黄色晶体状粉末
纯度：>98.0%
摩尔吸光度：>63,000 (257 nm)
参考文献
1) K-C. Tsou, C-S. Cheng, M. M. Nachlas and A. M. Seligman, "Synthesis of Some p-Nitrophenyl Substituted Tetrazolium Salts Electron Acceptors for the Demonstration of Dehydrogenases", J. Am. Chem. Soc., 1956, 78, 6139.
2) J. R. Baker, D. V. Zyzak, S. R. Thorpe and J. W. Baynes, "Mechanism of Fructosamine Assay: Evidence against Role of Superoxide as Intermediate in Nitroblue Tetrazolium Reduction", Clin. Chem., 1993, 39, 2460.
TB试剂 货号：T012
3,3'-[3,3'-Dimethoxy-(1,1'-biphenyl)-4,4'-diyl]bis(2,5-diphenyl-2H-tetrazolium chloride)
CAS号：1871-22-3
商品信息
储存条件：室温，避光，防潮
运输条件：室温
分子式：C40H32Cl2N8O2 分子量：727.64
产品描述
TB微溶于水，但难溶于丙 酮、乙酸乙酯和醚。甲醇、乙醇和四 氯甲烷等其他有机溶剂可以很好地溶解TB。由于TB可被脱氢酶轻易地还原产生紫红色甲臜染料凝聚物，因此它可以用于组织样品中的脱氢酶检测。
反应式
产品详情
外观：浅黄色或浅橙黄色粉末
摩尔吸光度：>52,500 (254 nm)
参考文献
1. K. Tsou, et al., Synthesis of Some p-Nitrophenyl Substituted Tetrazolium Salts Electron Acceptors for the Demonstration of Dehydrogenases. J Am Chem Soc. 1956;78:6139-6144.
2. S. S. Karmarkar, et al., Preparation of Nitrotetrazolium Salts Containing Benzothiazole. J Org Chem. 1960;25:575-578.
3. J. E. Sinsheimer, et al., Reactivity of Blue Tetrazolium with Nonketol Compounds. Anal Chem. 1965;37:566-569.
ACES试剂 货号：GB01
N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid
CAS号：7365-82-4
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C4H10N2O4S 分子量：182.2
ADA试剂 货号：GB02
N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid
CAS号：26239-55-4
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C6H10N2O5 分子量：190.15
BES试剂 货号：GB03
N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid
CAS号：10191-18-1
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C6H15NO5S 分子量：213.25
Bicine试剂 货号：GB04
N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycine
CAS号：150-25-4
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C6H13NO4 分子量：163.17
Bis-Tris试剂 货号：GB05
Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methane
CAS号：6976-37-0
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C8H19NO5 分子量：209.24
EPPS试剂 货号：GB09
3-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]propanesulfonic acid
CAS号：16052-06-5
商品信息
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温
分子式：C9H20N2O4S 分子量：252.33
HEPES试剂 货号：GB10
2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid
CAS号：7365-45-9
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C8H18N2O4S 分子量： 238.31
HEPPSO试剂 货号：GB11
2-Hydroxy-3-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]propanesulfonic acid, monohydrate
CAS号：68399-78-0
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C9H20N2O5S･H2O 分子量：286.35
MES试剂 货号：GB12
2-Morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate
CAS号：145224-94-8
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C6H13NO4S･H2O 分子量：213.25
MOPS试剂 货号：GB13
3-Morpholinopropanesulfonic acid
CAS号：1132-61-2
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C7H15NO4S 分子量：209.26
MOPSO试剂 货号：GB14
2-Hydroxy-3-morpholinopropanesulfonic acid
CAS号：68399-77-9
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C7H15NO5S 分子量：225.26
PIPES试剂 货号：GB15
P-iperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)
CAS号：5625-37-6
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C8H18N2O6S2 分子量：302.37
TAPS试剂 货号：GB17
N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid
CAS号：29915-38-6
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C7H17NO6S 分子量：243.28
TES试剂 货号：GB18
N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid
CAS号：7365-44-8
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C6H15NO6S 分子量： 229.25
Tricine试剂 货号：GB19
N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycine
CAS号：5704-04-1
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C6H13NO5 分子量：179.17
TAPSO试剂 货号：GB20
2-Hydroxy-N-tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid
CAS号：68399-81-5
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C7H17NO7S 分子量：259.28
PIPES sesquisodium试剂 货号：GB25
P -iperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), sesquisodium salt, monohydrate
CAS号：100037-69-2
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C8H16.5N2Na1.5O6S2･H2O 分子量：353.36
BIGCHAP试剂 货号：B043
N,N-Bis(3-D-gluconamidopropyl)cholamide
CAS号：86303-22-2
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C42H75N3O16 分子量：878.06
CHAPS试剂 货号：C008
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate
CAS号：75621-03-3
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C32H58N2O7S 分子量：614.88
CHAPSO试剂 货号：C020
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxypropanesulfonate
CAS号：82473-24-3
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C32H58N2O8S 分子量：630.88
Sodium cholate (purified)试剂 货号：C321
Cholic acid, sodium salt, monohydrate
CAS号：361-09-1
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C24H39NaO5･H2O 分子量：448.57
deoxy-BIGCHAP试剂 货号：D045
N,N-Bis(3-D-gluconamidopropyl)deoxycholamide
CAS号：86303-23-3
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C42H75N3O15 分子量：862.06
n-Dodecyl-β-D-maltoside试剂 货号：D316
N-Dodecyl-β-D-maltopyranoside
CAS号：69227-93-6
商品信息
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温
分子式：C24H46O11 分子量：510.62
Detergent Screening Set (first choice-II)试剂盒 货号：DS06
去垢剂筛选试剂盒（首 选II）
Detergent Screening Set (first choice-II)
商品信息
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温
n-Heptyl-β-D-thioglucoside试剂 货号：H015
n-Heptyl-β-D-thioglucopyranoside
CAS号：85618-20-8
商品信息
储存条件：0-5度保存
运输条件：室温
分子式：C13H26O5S 分子量：294.41
MEGA-8试剂 货号：M014
n-Octanoyl-N-methyl-D-glucamine
CAS号：85316-98-9
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C15H31NO6 分子量：321.41
MEGA-9试剂 货号：M015
n-Nonanoyl-N-methyl-D-glucamine
CAS号：85261-19-4
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C16H33NO6 分子量：335.44
MEGA-10试剂 货号：M016
n-Decanoyl-N-methyl-D-glucamine
CAS号：85261-20-7
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C17H35NO6 分子量：349.46
n-Nonyl-β-D-thiomaltoside试剂 货号：N373
n-Nonyl-β-D-thiomaltopyranoside
CAS号：148565-55-3
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储存条件：0-5度保存
运输条件：室温
分子式：C21H40O10S 分子量：484.6
n-Octyl-β-D-glucoside试剂 货号：O001
N-Octyl-β-D-glucopyranoside
CAS号：29836-26-8
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储存条件：0-5度保存
运输条件：室温
分子式：C14H28O6 分子量：292.37
n-Octyl-β-D-thioglucoside试剂 货号：O003
n-Octyl-β-D-thioglucopyranoside
CAS号：85618-21-9
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储存条件：0-5度保存
运输条件：室温
分子式：C14H28O5S 分子量：308.44
Trehalose C12试剂 货号：T461
α-D-Glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside monododecanoate
CAS号：64622-91-9
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储存条件：0-5度保存，防潮
运输条件：室温
分子式：C24H44O12 分子量：524.6
Trehalose C14试剂 货号：T464
α-D-Glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside monomyristate
CAS号：64622-92-0
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储存条件：0-5度保存，防潮
运输条件：室温
分子式：C26H48O12 分子量：552.65
PAN试剂 货号：P002
1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚（1-(2-Pyridylazo)-2-naphthol）
CAS号：85-85-8
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储存条件：室温
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分子式：C15H11N3O 分子量：249.27
ALC试剂 货号：A006
3-[N,N-Bis(carboxymethyl)aminomethyl]-1,2-dihydroxyanthraquinone
CAS号：3952-78-1
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储存条件：室温，避光
运输条件：室温
分子式：C19H15NO8 分子量：385.32
Arsemate试剂 货号：A012
Diethyldithiocarbamic acid, silver salt
CAS号：1470-61-7
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储存条件：室温，避光
运输条件：室温
分子式：C10AgNS2 分子量：256.14
Azomethine H试剂 货号：A015
8-Hydroxy-1-(salicylideneamino)-3,6-naphthalenedisulfonic acid, sodium salt
CAS号：5941-07-1
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储存条件：室温，避光
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分子式：C17H12NNaO8S2 分子量：445.4
Bathocuproinedisulfonic acid, disodium salt试剂 货号：B002
2,9-Dimethyl-4,7-diphenyl-1,10-phenanthrolinedisulfonic acid, disodium salt
CAS号：98645-85-3
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储存条件：室温，避光
运输条件：室温
分子式：C26H18N2Na2O6S2 分子量：564.54
Bathophenanthrolinedisulfonic acid, disodium salt 货号：B004
4,7-Diphenyl-1,10-phenanthrolinedisulfonic acid, disodium salt
CAS号：98645-86-4
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储存条件：室温，避光
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分子式：C24H14N2Na2O6S2 分子量：536.49
BT试剂 货号：B015
2-Hydroxy-1-(1-hydroxy-2-naphthylazo)-6-nitro-4-naphthalenesulfonic acid, sodium salt
CAS号：1787-61-7
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C20H12N3NaO7S 分子量：461.38
Bis(benzo-15-crown-5)试剂 货号：B020
Bis[(benzo-15-crowN-5)-4-methyl]pimelate
CAS号：69271-98-3
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C37H52O14 分子量：720.8
Bis(12-crown-4)试剂 货号：B021
Bis[(12-crowN-4)methyl] 2-dodecyl-2-methylmalonate
CAS号：80403-59-4
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C34H62O12 分子量：662.85
5-Br-PAPS试剂 货号：B026
2-(5-Bromo-2-pyridylazo)-5-[N-N-propyl-N-(3-sulfopropyl)amino]phenol, disodium salt, dihydrate
CAS号：81608-06-2(free acid)
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分子式：C17H19BrN4Na2O4S･2H2O 分子量：537.34
产品概述
5-Br-PAPS是5-Br-PADAP的水溶性衍生物，是一种用来检测锌的高度敏感的比色试剂。这种试剂可以在pH 7.5-9.5 (λmax=552 nm, ε=130,000)下与锌形成红色螯合物。5-Br-PAPS还能用来测定Cu(I), Fe(I),Ni(I), Co(I), P(I), Ru(I)和Rh(I)以及Zn, Cu, Fe, Ni和Co的血清水平。为了测定血清Zn水平，可以用柠檬酸或者偏磷酸掩蔽掉Fe离子，2-巯 基苯并咪唑或二硫代肌氨酸掩蔽掉氟化物和Cu离子。5-Br-PAPS-Ti络合物能被用于过氧化氢检测。
5-Br-PAPS- 金属复合物的光谱数据
参考文献
1. T. Makino, et al., A Highly Sensitive Colorimetric Determination of Serum Zinc Using Water-soluble Pyridylazo Dye. Clin Chim Acta. 1982;120:127-135.
2. D. Horiguchi, et al., Water Soluble Pyridylazoaminophenols and Pyridylazoaminobenzoic Acids as Highly Sensitive Photometric Reagents for Zinc, Uranium, Cobalt and Nickel. Anal Sci. 1985;1:461-465.
3. C. Matsubara, et al., Spectrophotometric Determination of Hydrogen Peroxide with Titanium 2-((5-bromopyridyl)azo)-5-(N-proryl-N-sulfopropylamino) phenol Reagent and Its Application to the Determination of Serum Glucose Using Glucose Oxidase. Anal Chem. 1985;57:1107-1109.
4. Y. Shijo, et al., Spectrophotometric and Analogue Derivative Spectrophotometric Determination of Chromium(III) with 2-(5-Bromo-2-pyridylazo)-5-(NOpropyl-N-sulfopropylamino)phenol. Bull Chem Soc Jpn. 1986;59:1455-1458.
5. Y. Shijo, et al., Spectrophotometric and Analogue Derivative Spectrophotometric Determination of Rhodium(III) with 2-(5-Bromo-2-pyridylazo-5-propyl-N-sulphopropylamino)phenol. Analyst. 1988;113:519-521.
6. Y. Shijo, et al., High Performance Liquid Chromatographic Separation of Iron, Bismuth, Indium and Thallium by Pre-column Chelation with 2-(5-Bromo-2-pyridylazo)-5-(N-propyl-N-sulphopropylamino)phenol. Analyst. 1988;113:1201-1203.
7. C. Ohtsuka, et al., Reversed-phase Ion-pair Partition Liquid Chromatoguraphy of Chelates with 2-(3,5-Dibromo-2-pyridylazo)-5-[N-ethyl-N-(3-sulphopropyl) amino]phenol and Analogues. Anal Chim Acta. 1989;223:339-347.
8. I. Kasahara, et al., Bis[2-(5-Bromo-2-pyridylazo)-5-(N-propyl-N-sulphopropylamino)phenolato]cobaltate(III) as a Counter Ion for the Extraction and Spectrophotometric Determination of Long-chain Quaternary Ammonium Salts and Tertiary Alkylamines in the Presence of Each Other. Anal Chim Acta. 1989;219:239-245.
9. N. Uehara, et al., Simultaneous Determination of Platinum(II), Rhodium(III) and Palladium(II) with 2-(5-Bromo-2-pyridylazo)-5-(N-propyl-N-sulfopropylamino) phenol by High Performance Liquid Chromatography. Anal Sci. 1989;5:111-112.
10. Y. Hayashibe, et al., Direct Determination of Zinc in Human Serum by Flow-injection Spectrophotometric Analysis. Anal Sci. 1994;10:795-799.
11. N. Uehara, et al., Determination of Cobalt in Natural Water as a 2-(5-Bromo-2-pyridylazo)-5-[N-propyl-N-(3-sulphopropyl)amino]phenol Chelate by On-Line Preconcentration HPLC with Column-Switching Technique. Anal Sci. 1998;14:343-348.
Sodium bicinchoninate试剂 货号：B037
4,4'-Dicarboxy-2,2'-biquinoline, disodium salt
CAS号：979-88-4
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储存条件：室温
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分子式：C20H10N2Na2O4 分子量：388.28
Calcein试剂 货号：C001
Bis[N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl]fluorescein
CAS号：1461-15-0
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C30H26N2O13 分子量：622.53
Chlorophosphonazo-III试剂 货号：C010
2,7-Bis(4-chloro-2-phosphonophenylazo)-1,8-dihydroxy-3,6-naphthalenedisulfonic acid
CAS号：1914-99-4
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C22H16Cl2N4O14P2S2 分子量： 757.37
产品概述
Chlorophosphonazo-III是钍、铀、镧、锿和碱土金属的比色试剂，易溶于水，在pH＜4时呈紫色，在氢氧 化钠溶液中呈蓝色，在酸溶液，如硫酸，盐酸和稀硝酸中 (它在浓硝酸中分解) 呈亮绿色。据报道它的质子解离常数为-1.1, -1.1, 0.6, 0.8, 1.5, 2.5, 5.47, 7.20, 12.15, 15.13 (μ=0.1, 20℃)。Chlorophosphonazo-III在pH 2-3的混合Ca/Mg样品中，可以用作钙的选择性比色试剂。在使用Ba2+作为标准溶液沉淀滴定硫酸根离子，它也是一个有用的指示剂。
使用Chlorophosphonazo-III的金属检测条件
参考文献
1) K. Ueno, T. Imamura and K. L. Cheng, "Handbook of Organic Analitical Reagents 2nd Edition", CRC Press, 1992.
2) L. R. Snyder and B. E. Buell, "Characterization and Routine Determination of Nonbasic Nitrogen Types in Cracked Gas Oils by Linear Elution Adsorption Chromatography", Anal. Chem., 1964, 36(4), 767.
3) J. W. Ferguson, J. J. Richard, J. W. O'laughlin and C. V. Banks, "Simultaneous Spectrophotometric Determination of Calcium and Magnesium with Chlorophosphonazo-III", Anal. Chem., 1964, 36, 796.
4) D. S. Howell, J. C. Pita, J. F. Marquez, "Ultramicro Spectrophotometric Determination of Calcium in Biologic Fluids", Anal. Chem., 1966, 38, 434.
5) T. Yamamoto, "Extraction-photometric Determination of Uranium(IV) with Chlorophosphonazo-III", Anal. Chim. Acta, 1973, 65, 329.
6) M. Zenki, T. Masutani and T. Yokoyama, "Repetitive Determination of Calcium Ion and Regeneration of a Chromogenic Reagent Using Chlorophosphonazo III and an Ion Exchanger in a Circulatory Flow Injection System", Anal. Sci., 2002, 18, 1137.
Calcein Blue试剂 货号：C002
8-[N,N-Bis(carboxymethyl)aminomethyl]-4-methylumbelliferone
CAS号：54375-47-2
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C15H15NO7 分子量：321.28
Cesibor试剂 货号：C007
Tetrakis(4-fluorophenyl)borate, sodium salt, dihydrate
CAS号：25776-12-9
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储存条件：0-5度保存
运输条件：室温
分子式：C24H16BF4Na･2H2O 分子量：450.21
Diantipyrylmethane试剂 货号：D008
Di(4-antipyryl)methane, monohydrate
CAS号：1251-85-0
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C23H24N4O2･H2O 分子量：406.48
Cu-PAN试剂 货号：C016
Composite preparation of Cu-EDTA and PAN(Ratio 11.1:1)
Cu-PAN
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储存条件：室温
运输条件：室温
DAN试剂 货号：D027
2,3-Diaminonaphthalene
CAS号：771-97-1
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储存条件：-20度保存，避光
运输条件：室温
分子式：C10H10N2 分子量：158.2
Cyanoline Blue试剂 货号：C017
Composite preparation of monopyrazolone and bispyrazolone
Cyanoline Blue
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储存条件：室温
运输条件：室温
3,5-DiBr-PAESA试剂 货号：D041
4-(3,5-Dibromo-2-pyridylazo)-N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)aniline, monosodium salt, monohydrate
CAS号：100743-65-5
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：：C16H17Br2N4NaO3S･H2O 分子量：546.21
产品概述
3,5-DiBr-PAESA是一种极 佳的检测Ag(I)和Cu(II)的比色试剂。它与Ag(I)复合物的最大吸收波长和摩尔吸光系数分别为618 nm和80,000，与Cu(II)复合物的最大吸收波长和摩尔吸光系数分别为639 nm和1.34×105，当与阴离子表面活性剂如十二烷基硫酸钠共存时，复合物的最大吸收波长将变长，摩尔吸光系数将增大。
参考文献
K. Ohshita, et al, Anal. Chim. Acta, 176, 41 (1985); K. Ohshita, et al, Anal. Chim. Acta, 182, 157 (1986); A. Abe, et al, Clin. Chem.,35, 552 (1989).
Dibenzyl-14-crown-4试剂 货号：D043
6,6-Dibenzyl-1,4,8,11-tetraoxacyclotetradecane
CAS号：106868-21-7
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C24H32O4 分子量：384.51
HNB试剂 货号：H007
2-Hydroxy-1-(2-hydroxy-4-sulfo-1-naphthylazo)-3,6-naphthalenedisulfonic acid, trisodium salt
CAS号：63451-35-4
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C20H11N2Na3O11S3 分子量：620.48
HFPB试剂 货号：H209
Tetrakis[3,5-bis(1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-methoxy-2-propyl)phenyl]borate,sodium salt,trihydrate
CAS号：120945-63-3
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C56H36BF48NaO8˙3H2O 分子量：1836.65
Kalibor试剂 货号：K003
Tetraphenylborate, sodium salt
CAS号：143-66-8
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C24H20BNa 分子量：342.22
Murexide试剂 货号：M011
Purpuric acid, ammonium salt
CAS号：3051-09-0
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C8H8N6O6 分子量：284.19
Nitroso-PSAP试剂 货号：N010
2-Nitroso-5-[N-n-propyl-N-(3-sulfopropyl)amino]phenol
CAS号：80459-15-0
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储存条件：0-5度保存
运输条件：室温
分子式：C12H18N2O5S 分子量：302.35
NN diluted with potassium sulfate试剂 货号：N012
Composite preparation of 2-hydroxy-1-(2-hydroxy-4-sulfo-1-naphthylazo)-3-naphthoic acid and potassium sulfate
NN diluted with potassium sulfate
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储存条件：室温
运输条件：室温
NN试剂 货号：N013
2-Hydroxy-1-(2-hydroxy-4-sulfo-1-naphthylazo)-3-naphthoic acid
CAS号：3737-95-9
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C21H14N2O7S 分子量：438.41
Nitro-PAPS试剂 货号：N031
2-(5-Nitro-2-pyridylazo)-5-[N-n-propyl-N-(3-sulfopropyl)amino]phenol, disodium salt, dihydrate
CAS号：143205-66-7（无水物）
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C17H19N5Na2O6S･2H2O 分子量：503.45
产品概述
Nitro-PAPS是检测Fe(II)的高度敏感性比色试剂，在pH 3.0-8.0 (λmax=582 nm, ε=107,000)时形成水溶性复合物。该试剂适合于检测血清中的Fe(II)，也可用于检测微摩尔水平的Cu、Zn、Ni、Co。可用硫基乙酸和SDS复合物掩蔽血清中的Cu和Zn。用CN-作为掩蔽Fe和Cu的试剂，Nitro-PAPS可以检测血清中的Zn。
Spectral Data of Nitro-PAPS-Metal Complex
参考文献
1) T. Makino, M. Kiyonaga and K. Kina, "A Sensitive, Direct Colorimetric Assay of Serum Iron Using the Chromogen, Nitro-PAPS", Clin. Chim. Acta, 1988, 171, 19.
2) T. Makino, "A Sensitive, Direct Colorimetric Assay of Serum Zinc Using Nitro-PAPS and Microwell Plates", Clin. Chim. Acta, 1991, 197, 209.
3) S. Yamashita, A. Abe and A. Noma, "Sensitive, Direct Procedures for Simultaneous Determination of Iron and Copper in Serum, with Use of 2-(5-Nitro-2-pyridylazo)-5-(N-propyl-N-sulfopropylamino)phenol(Nitro-PAPS) as Ligand", Clin. Chem., 1992, 38, 1373.
4) T. Yamane and H. Yamada, "Flow-injection Spectrophotometric Determination of Trace Iron in Various Salts. Elimination of Blank Peak Effect and Use of 2-(5-Nitro-2-pyridylazo)-5-(N-propyl-N-sulfopropylamino)phenol as Chromogenic Agent.", Anal. Chim. Acta, 1995, 308(1-3), 433.
5) T. Yamane and Y. Yamaguchi, "Complex Formation of 2-(5-Nitro-2-pyridylazo)-5-(N-propyl-N-sulfopropylamino)phenol with Lead, Cadmium and Manganese for Their Sensitive Spectrophotometric Detection in Flow Injection and Ion Chromatography Systems.", Anal. Chim. Acta, 1997, 345(1-3), 139.
6) T. Yamane and Y. Yamaguchi, "2-(5-Nitro-2-pyridylazo)-5-(N-propyl-N-sulfopropylamino)phenol as a New Analytical Reagent for Flow-injection Spectrophotometric Determination of Trace Vanadium(V)", Mikrochim. Acta, 1998, 130(1), 111.
PAR试剂 货号：P003
4-(2-Pyridylazo)resorcinol
CAS号：1141-59-9
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C11H9N3O2 分子量：215.21
PC试剂 货号：P004
3,3'-Bis[N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl]-o-cresolphthalein
CAS号：2411-89-4
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C32H32N2O12 分子量：636.6
o-Phenanthroline试剂 货号：P007
1,10-Phenanthroline, monohydrate
CAS号：5144-89-8
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C12H8N2･H2O 分子量：198.22
TPPS试剂 货号：T003
5,10,15,20-Tetraphenyl-21H,23H-porphinetetrasulfonic acid, disulfuric acid, tetrahydrate
CAS号：35218-75-8（无水物）
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C44H34N4O20S6･4H2O 分子量：1203.21
TFPB试剂 货号：T037
Tetrakis[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]borate, sodium salt, dihydrate
CAS号：79060-88-1
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C32H12BF24Na 分子量：886.2
XB-I试剂 货号：X001
3-[3-(2,4-Dimethylphenylcarbamoyl)-2-hydroxynaphthaleN-1-ylazo]-4-hydroxybenzenesulfonic acid, sodium salt
CAS号：14936-97-1
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C25H20N3NaO6S 分子量：513.5
产品概述
XB-I是检测Mg的比色试剂。它微溶于水和乙醇，易溶于碱性溶液。XB-I的水溶液呈红色，在pH 9且Mg存在时转为红紫色。(最大波长：510 nm，摩尔吸光系数：49,000，检测范围0.02-0.4 ppm)。
参考文献
C. K. Mann, et al., Spectrophotometric Determination of Magnesium with 1-Azo-2-hydroxy-3-(2,4-dimethylcarboxanilido)naphthalene-1 E(2-hydroxybenzene). Anal Chim Acta. 1957;16:155-160.
XO试剂 货号：X003
3,3'-Bis[N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl]-o-cresolsulfonphthalein, disodium salt
CAS号：1611-35-4
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C31H30N2Na2O13S 分子量：716.62
Zincon试剂 货号：Z002
2-[1-(2-Hydroxy-5-sulfophenyl)-3-phenyl-5-formazano]benzoic acid, monosodium salt
CAS号：62625-22-3
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C20H15N4NaO6S 分子量：462.41
MX试剂 货号：M012
紫脲酸铵和硫酸钾的混合物
MX
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储存条件：室温
运输条件：室温
HIDA试剂 货号：H006
N-(2-Hydroxyethyl)iminodiacetic acid
CAS号：93-62-9
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C6H11NO5 分子量：177.16
IDA试剂 货号：I001
Iminodiacetic acid
CAS号：142-73-4
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C4H7NO4 分子量：133.1
2K(EDTA・2K)试剂 货号：K001
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid, dipotassium salt, dihydrate
CAS号：25102-12-9
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C10H14K2N2O8･2H2O 分子量：404.45
3K(EDTA・3K)试剂 货号：K002
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid, tripotassium salt, dihydrate
CAS号：65501-24-8
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C10H13K3N2O8･2H2O 分子量：442.54
2NA(EDTA・2Na)试剂 货号：N001
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate
CAS号：6381-92-6
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C10H14N2Na2O8･2H2O 分子量：372.24
4NA(EDTA・4Na)试剂 货号：N003
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid, tetrasodium salt, tetrahydrate
CAS号：13235-36-4
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C10H12N2Na4O8･4H2O 分子量：452.23
2NH4(EDTA・2NH4)试剂 货号：N008
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid, diammonium salt
CAS号：20824-56-0
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储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C10H22N4O8 分子量：326.3
Cu(II)-EDTA试剂 货号：E010
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid, copper(II), disodium salt, tetrahydrate
CAS号：39208-15-6
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C10H12CuN2Na2O8･4H2O 分子量：469.8
Fe(III)-EDTA试剂 货号：E011
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid, iron(III), sodium salt, trihydrate
CAS号：15708-41-5
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C10H12FeN2NaO8･3H2O 分子量：421.09
Mg(II)-EDTA试剂 货号：E013
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid, magnesium(II), disodium salt, tetrahydrate
CAS号：14402-88-1
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C10H12MgN2Na2O8･4H2O 分子量：430.56
Zn(II)-EDTA试剂 货号：E017
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid, zinc(II), disodium salt, tetrahydrate
CAS号：14025-21-9
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C10H12N2Na2O8Zn･4H2O 分子量：471.64
4H(EDTA・free acid)试剂 货号：H001
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid
60-00-4
商品信息
储存条件：室温
运输条件：室温
分子式：C10H16N2O8 分子量：292.24
Lipi-Blue试剂货号：LD01
脂滴检测（蓝色）
Lipi-Blue
商品信息
储存条件：在冷暗处保存
运输条件：室温
特点：
● 高特异性脂滴定位
● 可进行组织脂滴成像
● 多种颜色可供选择
概述
Lipi系列探针是高脂肪亲脂性小分子探针，其在疏水环境例如脂滴中发出强荧光。活细胞和固定细胞中的脂滴都可以使用本试剂清楚地观察。
原理
脂滴(脂肪滴，Lipid droplets, LDs)由中性脂肪组成，主要包括甘油三酯和胆固醇酯，其外层被一层单层磷脂分子包裹。而且脂滴不仅在脂肪细胞中存在，在真核生物中也普遍存在。最 新的研究表明，以前认为脂滴仅是一个简单的脂质储存器，但最近的研究表明其在调节脂质代谢1)，自噬2)和细胞衰老3)等方面都起着重要作用，因此需要进一步详细地研究脂滴形成·成长·融合·分解的机制。Lipi系列探针是高脂肪亲油性小分子探针，可在疏水环境例如脂滴中发出强荧光。Lipi探针染色后，无须洗涤即可观察到脂滴。
1) T. Fujimoto et al., “Lipid droplets: a classic organelle with new outfits.” Histochem Cell Biol., 2008, 130(2), 263.
2) R. Singh et al., “Autophagy regulates lipid metabolism.” Nature, 2009, 458(7242), 1131.
3) M. Yokoyama et al., “Inhibition of endothelial p53 improves metabolic abnormalities related to dietary obesity.” Cell Reports, 2014, 7(5), 1691.
脂滴的染色例
在活细胞状态下，用油酸诱导HeLa细胞后，用不同颜色的Lipi系列荧光探针检测
检测条件：
* Lipi-Blue ：Ex：405 nm, Em：450–500 nm
* Lipi-Green：Ex：488 nm, Em：500–550 nm
* Lipi-Red：Ex：561 nm, Em：565–650 nm
* Lipi-Deep Red：Ex：640 nm, Em：650–700 nm
染色条件：
在HeLa细胞培养基中加入200 μmol/l油酸，过夜培养后，用PBS清洗细胞，并分别加入不同颜色的Lipi探针(Lipi-Blue/Green/Deep Red：0.1 μmol/l、Lipi-Red：1 μmol/l) 染色15 min后观察。
如何制备油酸溶液
请参考Q&A“油酸溶液的制备和加入细胞的方法”。
与竞争品比较
Lipi系列荧光探针大幅度地改善了现有脂滴染色试剂存在的问题 (如选择性，滤波器的适应性，荧光滞留性)。而且 Lipi系列荧光探针也适用于多重染色实验，可选颜色更多。
| 同仁化学试剂 | 其他品牌（T公司） | ||||||
| Lipi-Blue | Lipi-Green | Lipi-Red | Lipi-Deep Red | Oil Red O (比色) |
Nile Red | 试剂B | |
| 活细胞染色 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 | × | 〇 | 〇 |
| 固定细胞染色 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 |
| 对脂肪滴的选择性 (低背景) |
〇 | 〇 | 〇 | 〇 | × | × | △ |
| 与其他试剂的共染色*1 | 〇 | 〇 | 〇*2 | 〇 | n.d. | ×*3 | 〇 |
| 活细胞内的滞留性(24h) | 〇 | 〇 | × | × | n.d. | × | × |
*1. 与绿色荧光共染时，推荐使用550 nm以下的绿色荧光滤光片。
*2. 关于共染时推荐的荧光滤光片，您可以参考网页下方Q&A“共染时推荐的荧光滤光片”。
*3. 用GFP的滤光片(500~540 nm)时会串色。
产品特点
特点1：与抗体检测方法高度相似
4％PFA固定HepG2细胞后，用100 nmol/l Lipi-Blue染色。 然后在脂滴膜上用抗ADFP抗体荧光标记，免疫染色， 该抗体可以特异性标记脂滴膜上的蛋白质 (Adipophilin; ADFP)。 实验证明Lipi-Blue与脂滴上蛋白质ADFP的定位高度相关。
<检测条件>
Lipi-Blue：Ex：405 nm / Em：450-500 nm，
抗ADFP抗体(Alexa Fluor 647)：Ex：640 nm / Em：650-700 nm
特点2：高特异性定位脂滴
在HeLa活细胞中加入油酸，并用100 nmol/l Lipi-Blue和100 nmol/l Nile Red（T公司）染色。该结果显示Nile Red会染上脂滴以外的其它细胞质。
<检测条件>
Lipi-Blue：Ex：405 nm / Em：450-500 nm，
Nile Red：Ex：561 nm / Em：565-650 nm
特点3：荧光在细胞中滞留时间长
分别用Lipi系列、Nile Red和市售的试剂B染色HepG2细胞，观察在培养30 min和24 h时的荧光图像。
实验证实Lipi-Blue和Lipi-Green在培养24 h后虽然荧光强度有所降低，但仍有荧光。 而Lipi-Red，Lipi-Deep Red，Nile Red和市售试剂B在培养24 h后几乎无荧光，不适合长时间的实时成像观察。
实验例
实验例1：脂肪细胞的脂滴成像
用Lipi系列染色3T3-L1前脂肪细胞，可以清楚地检测出脂肪细胞中的脂质。
<脂肪细胞染色实验例>
(1)将3T3-L1细胞(1.5x104cells/孔)接种在µ-Plate 96孔板（ibidi）的各孔中，并在37℃ 5% CO2培养箱内培养。
(2)按照常规方法诱导分化为脂肪细胞。
(3) 去除上清液，用DMEM（25 mmol/l葡萄糖, 10% FBS, 无酚红）洗涤两次。
(4)加入用DMEM（25 mmol/l葡萄糖，10％FBS，无酚红）制备的每种染料的工作溶液，并在37℃下培养24 h。
(5)用荧光显微镜观察。
※试剂浓度：各2.5 µmol/l
实验例2：脂肪组织的脂滴成像
用4%PFA固定小鼠肝脏脂肪组织(冰冻切片)后用Lipi系列染色，比较幼鼠(6周龄)和老年小鼠(31周龄)的脂滴成像图像，发现肝脏脂肪组织中的脂滴量有很大差异。
<组织样品的染色实验例>
(1)向小鼠肝脏脂肪组织(冰冻切片)中加入4%PFA(PBS)，在室温下静置5 min。
(2)用PBS清洗后，加入各浓度的Lipi系列working solution（PBS），在4℃下静置24 h。
(3)用PBS清洗后，用落射型荧光显微镜进行荧光观察。
※工作液浓度：2.5 µmol/l(Lipi-Blue、Lipi-Green、Lipi-Deep Red)、25 µmol/l(Lipi-Red)
实验例3：使用细胞成像仪进行定量分析
将油酸或Triacsin C(acyl-CoA synthetase抑制剂）分别加入到HepG2细胞中，并比较脂滴的变化。在分析中，我们使用共聚焦定量细胞成像仪(横河电机株式会社 CQ1)获得每个细胞脂滴数量和面积的数据。
脂肪滴和细胞核的成像
使用共聚焦定量细胞成像仪在447/60 nm处拍摄脂滴图像，在525/50 nm处拍摄细胞核图像，在分析软件CellPathfinder中识别单个脂滴和细胞核，并计算其数量和面积。
横河电机CQ1拍摄条件
使用板：96 well plate，物镜：20倍
激发波长 ：405 nm (Lipi-Blue)：蓝色、488 nm (SYBR Green)： 绿色
黄框线：细胞核、红框线：脂滴
脂滴数量及面积的分析
根据细胞核和脂滴的检测数据，每个细胞的脂滴的数量和面积如图所示。结果，加入油酸的脂滴增加了7-10倍，而加入Triacsin C抑制了脂滴的形成，脂滴数量减少到Control组的50-60%。
细胞处理及脂滴染色条件
将HepG2细胞(1x103cells)接种到96孔板中过夜培养。除去培养上清液后，加入未处理（仅含FBS的DMEM培养基）、油酸（含200 μmol/l油酸和FBS的DMEM培养基）或Triacsin C（含5 µmol/l Triacsin C和FBS的DMEM培养基）过夜培养。之后用PBS 清洗2次，用4%的PFA在室温下固定5 min后，用PBS 清洗2次。最后，加入0.5 μmol/l Lipi-Blue working solution在室温、避光下染色2 h后，用共聚焦定量细胞成像仪进行定量分析。
Lipi系列荧光图谱
脂肪滴产品种类的检测方法
| 产品名称 | 规格 | 货号 | |||
| 成像(成像) 脂滴荧光探针 |
Lipi-Blue | 10 nmol | LD01 | ||
| Lipi-Green | 10 nmol | LD02 | |||
| Lipi-Red | 100 nmol | LD03 | |||
| Lipi-Deep Red | 10 nmol | LD04 | |||
| 定量（荧光酶标仪，FCM） 脂滴荧光检测试剂盒 |
Lipid Droplet Assay Kit - Blue | 1 set | LD05 | ||
| Lipid Droplet Assay Kit - Deep Red | 1 set | LD06 | |||
常用问题Q&A
| Q1：油酸溶液的制备和加入细胞的方法 |
| A1：我们按照以下步骤制备和使用油酸溶液。 <油酸储存溶液> 必要的试剂 ·BSA(牛血清白蛋白) ·油酸 ·0.1 mol/l Tris-HCl(pH8.0) 制备步骤 1)在0.1 mol/l Tris-HCl（pH8.0）中加入BSA并溶解（BSA：浓度0.14 g/ml）。 2)在容器(一次性的离心管)中加入油酸后，加入步骤1）得到的BSA溶液，使用涡旋振荡器进行混合(油酸浓度：4 mmol/l)。*1 3)用孔径为0.22 µm的注射式过滤器(PTFE)过滤步骤2)的混合溶液。 4)每次使用后冷藏保存。*2 * 1 油酸和BSA溶液混合可能导致液体混浊，继续摇动让油酸和BSA形成复合物使混浊会消失。 * 2 将所需量的油酸储备溶液加入到实验使用的培养基中，用于将油酸加入到细胞中。 <加入细胞的方法> 1)将细胞在37℃ 5%CO2培养箱内培养24 h。 2)用加入了油酸储备溶液的培养基(油酸的终浓度200 µmol/L)替换，再培养24 h。 3)然后按照说明书对脂滴进行荧光染色观察。 |
| Q2：共染时推荐的荧光滤光片。 |
|
|
| Q3：检测不到荧光信号的应对方法是什么？ |
| Q4如果没有检测到荧光信号，可能会有几个因素。 请确认以下内容，并根据情况考虑优化条件。 1.激发·发射波长与染料的荧光特性不一致。 确认说明书上的荧光图谱和您仪器的激发和发射波长是否匹配。 2.染色条件不是最合适的。 [试剂浓度] 确认工作液的浓度是否在以下范围内。 Lipi-Blue，Lipi-Green：0.1-0.5μmol/l Lipi-Red：1-5μmol/l *如果在上述条件下仍未检测到荧光信号，请提高染色浓度。 Lipi-Blue，Lipi-Green：1-2μmol/l Lipi-Red：10-20μmol/l [染色时间] -一般是30min，如没有荧光信号可以延长染色时间至1-2 h。 3.固定条件不适合。 根据细胞种类不同，染色前后的固定操作可能会导致无法染色或灵敏度减弱。 在这种情况下，“请参考Q&A：是否可以对固定细胞进行染色？。 4.脂滴小，难以确认。 根据细胞的不同，可能会有脂滴很小难以确认的情况。 这种情况下，我们建议在高倍率的显微镜下确认，或用油酸处理细胞作为阳性对照进行评估。 |
| Q4：是否可以对固定细胞进行染色? |
| A4：可以染色，固定细胞的染色步骤有以下注意事项： ※请用多聚 甲醛 (PFA) 固定细胞，不建议用甲醇等醇类固定细胞，因为可能会影响脂滴的结构。 ※部分细胞种类染色后，如果在固定细胞过程中出现无染色或染色强度不够的情况，需要摸索最佳固定条件。 ○细胞染色后固定实验例 (以HepG2细胞为例) 1. 将HepG2细胞接种在µ-Slide 8孔板上，并在37℃ 5% CO2培养箱中过夜培养。 2. 去除培养基，用PBS清洗2次。 3. 在细胞中加入用PBS配制的Lipi工作液，在37℃培养箱中培养15 min。 4. 去除上清液，用PBS清洗2次。 5. 加入4% PFA (在PBS中)，在室温固定5 min。 6. 去除上清液，用PBS清洗后，在荧光显微镜下观察。 ○细胞染色前固定实验例 (以HeLa细胞为例) 1. 将HeLa细胞接种在µ-Slide 8孔板上，并在37℃ 5% CO2培养箱中过夜培养。 2. 去除培养基，用PBS清洗2次。 3. 加入4% PFA (在PBS中)，在室温固定5 min。 4. 去除上清液，用PBS清洗2次。 5. 在细胞中加入用PBS配制的Lipi工作液，在37℃培养箱中培养30 min。 6. 去除上清液，用PBS清洗后，在荧光显微镜下观察。 |
参考文献
1) Y. Tatenaka, H. Kato, M. Ishiyama, K. Sasamoto, M. Shiga, H. Nishitoh and Y. Ueno, "Monitoring Lipid Droplet Dynamics in Living Cells by Using Fluorescent Probes", Biochemistry., 2019, DOI: 10.1021/acs.biochem.8b01071 .
Lipi-Green试剂 货号：LD02
脂滴检测（绿色）
Lipi-Green
商品信息
储存条件：在冷暗处保存
运输条件：室温
特点：
● 高特异性脂滴定位
● 可进行组织脂滴成像
● 多种颜色可供选择
概述
Lipi系列探针是高脂肪亲脂性小分子探针，其在疏水环境例如脂滴中发出强荧光。活细胞和固定细胞中的脂滴都可以使用本试剂清楚地观察。
原理
脂滴(脂肪滴，Lipid droplets, LDs)由中性脂肪组成，主要包括甘油三酯和胆固醇酯，其外层被一层单层磷脂分子包裹。而且脂滴不仅在脂肪细胞中存在，在真核生物中也普遍存在。最 新的研究表明，以前认为脂滴仅是一个简单的脂质储存器，但最近的研究表明其在调节脂质代谢1)，自噬2)和细胞衰老3)等方面都起着重要作用，因此需要进一步详细地研究脂滴形成·成长·融合·分解的机制。Lipi系列探针是高脂肪亲油性小分子探针，可在疏水环境例如脂滴中发出强荧光。Lipi探针染色后，无须洗涤即可观察到脂滴。
1) T. Fujimoto et al., “Lipid droplets: a classic organelle with new outfits.” Histochem Cell Biol., 2008, 130(2), 263.
2) R. Singh et al., “Autophagy regulates lipid metabolism.” Nature, 2009, 458(7242), 1131.
3) M. Yokoyama et al., “Inhibition of endothelial p53 improves metabolic abnormalities related to dietary obesity.” Cell Reports, 2014, 7(5), 1691.
脂滴的染色例
在活细胞状态下，用油酸诱导HeLa细胞后，用不同颜色的Lipi系列荧光探针检测
检测条件：
* Lipi-Blue ：Ex： 405 nm, Em： 450–500 nm
* Lipi-Green：Ex： 488 nm, Em：500–550 nm
* Lipi-Red：Ex： 561 nm, Em： 565–650 nm
* Lipi-Deep Red：Ex： 640 nm, Em： 650–700 nm
染色条件：
在HeLa细胞培养基中加入200 μmol/l油酸，过夜培养后，用PBS清洗细胞，并分别加入不同颜色的Lipi探针(Lipi-Blue/Green/Deep Red：0.1 μmol/l、Lipi-Red： 1 μmol/l) 染色15 min后观察。
如何制备油酸溶液
请参考Q&A“油酸溶液的制备和加入细胞的方法”。
与竞争品比较
Lipi系列荧光探针大幅度地改善了现有脂滴染色试剂存在的问题 (如选择性，滤波器的适应性，荧光滞留性)。而且 Lipi系列荧光探针也适用于多重染色实验，可选颜色更多。
| 同仁化学试剂 | 其他品牌（T公司） | ||||||
| Lipi-Blue | Lipi-Green | Lipi-Red | Lipi-Deep Red | Oil Red O (比色) |
Nile Red | 试剂B | |
| 活细胞染色 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 | × | 〇 | 〇 |
| 固定细胞染色 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 |
| 对脂肪滴的选择性 (低背景) |
〇 | 〇 | 〇 | 〇 | × | × | △ |
| 与其他试剂的共染色*1 | 〇 | 〇 | 〇*2 | 〇 | n.d. | ×*3 | 〇 |
| 活细胞内的滞留性(24h) | 〇 | 〇 | × | × | n.d. | × | × |
*1. 关于共染色时推荐的荧光滤光片，您可以参考网页下方Q&A“共染时推荐的荧光滤光片”。
*2. 与绿色荧光共染色时，推荐使用550 nm以下的绿色荧光滤光片。
*3. 用GFP的滤光片(500~540 nm)时会串色。
产品特点
特点1：与抗体检测方法高度相似
用4％PFA固定HepG2细胞后，用100 nmol/l Lipi-Green染色。 然后在脂滴膜上用抗ADFP抗体荧光标记，免疫染色， 该抗体可以特异性标记脂滴膜上的蛋白质 (Adipophilin; ADFP)。 实验证明Lipi-Green与脂滴上蛋白质ADFP的定位高 度相关。
<检测条件>
Lipi-Green：Ex：405 nm / Em:450-500 nm，
抗ADFP抗体(Alexa Fluor 647)：Ex：640 nm / Em:650-700 nm
特点2：高特异性定位脂滴
在HeLa活细胞中加入油酸，并用100 nmol/l Lipi-Green和100 nmol/l Nile Red（T公司）共染。右下图中黄色荧光部分为Lipi-Green 和Nile Red共染上的部分，结果显示Nile Red会染上脂滴以外的其它细胞质。
<检测条件>
Lipi-Green： Ex: 488 nm / Em: 500 - 550 nm
Nile Red：Ex: 561 nm / Em: 565-650 nm
特点3：荧光在细胞中滞留时间长
分别用Lipi系列、Nile Red和市售的试剂B染色HepG2细胞，观察在培养30 min和24 h时的荧光图像。
实验证实Lipi-Blue和Lipi-Green在培养24 h后虽然荧光强度有所降低，但仍有荧光。 而Lipi-Red，Lipi-Deep Red，Nile Red和市售试剂B在 培养24 h后几乎无荧光，不适合长时间的实时成像观察。
实验例
实验例1：脂肪细胞的脂滴成像
用Lipi系列染色3T3-L1前脂肪细胞，可以清楚地检测出脂肪细胞中的脂质。
<脂肪细胞染色实验例>
(1)将3T3-L1细胞(1.5x104cells/孔)接种在µ-Plate 96孔板（ibidi）的各孔中，并在37℃ 5% CO2培养箱内培养。
(2)按照常规方法诱导分化为脂肪细胞。
(3)去除上清液，用DMEM（25 mmol/l葡萄糖, 10% FBS, 无酚红）洗涤两次。
(4)加入用DMEM（25 mmol/l葡萄糖，10％FBS，无酚红）制备的每种染料的工作溶液，并在37℃下培养24 h。
(5)用荧光显微镜观察。
※试剂浓度：各2.5 µmol/l
实验例2：脂肪组织的脂滴成像
用4%PFA固定小鼠肝脏脂肪组织(冰冻切片)后用Lipi系列染色，比较幼鼠(6周龄)和老年小鼠(31周龄)的脂滴成像图像，发现肝脏脂肪组织中的脂滴量有很大差异。
<组织样品的染色实验例>
(1)向小鼠肝脏脂肪组织(冰冻切片)中加入4%PFA(PBS)，在室温下静置5 min。
(2)用PBS清洗后，加入各浓度的Lipi系列working solution（PBS），在4℃下静置24 h。
(3)用PBS清洗后，用落射型荧光显微镜进行荧光观察。
※工作液浓度：2.5 µmol/l(Lipi-Blue、Lipi-Green、Lipi-Deep Red)、25 µmol/l(Lipi-Red)
实验例3：利用高内含成像技术对药物引起的脂质性肝脏毒性的研究
将普萘洛尔（交感神经β受体阻断剂）加入人肝癌细胞系（HepG2细胞）后，用荧光显微镜观察脂肪滴的变化。通过荧光图像中脂肪滴的数量、面积和荧光强度的变化分析脂肪滴的积累情况。
脂肪滴的荧光成像
细胞核(Blue)： Ex. 385 nm/Em. 460 nm
脂肪滴 (Green)：Ex. 475 nm/Em. 535 nm
药物处理对脂肪滴积累的分析
通过分析荧光图像中的细胞数量和脂肪滴的面积、数量和荧光强度来了解细胞积累脂肪滴的情况。结果显示，脂肪滴的数量和面积随着普萘洛尔浓度的增加而上升，在浓度超过20μmol/l的条件下，脂肪滴的形成非常明显。DS-Qi2荧光显微镜可在一次拍摄中捕捉到广泛的细胞区域，而NIS-Elements软件的EDF模块可对所有脂肪滴进行更详细的定量数据统计分析。
<检测仪器>
高内涵成像系统(HTC)
(尼康：https://www.microscope.healthcare.nikon.com/zh_CN/products/high-content-imaging)
“有关染色操作、详细的分析方法等请参考尼康网站的 “Application Notes: Hepatotoxicity test of drug-induced lipidosis using high-content imaging”。
Lipi系列荧光图谱
脂肪滴产品种类的检测方法
| 产品名称 | 规格 | 货号 | |||
| 成像(成像) 脂滴荧光探针 |
Lipi-Blue | 10 nmol | LD01 | ||
| Lipi-Green | 10 nmol | LD02 | |||
| Lipi-Red | 100 nmol | LD03 | |||
| Lipi-Deep Red | 10 nmol | LD04 | |||
| 定量（荧光酶标仪，FCM） 脂滴荧光检测试剂盒 |
Lipid Droplet Assay Kit - Blue | 1 set | LD05 | ||
| Lipid Droplet Assay Kit - Deep Red | 1 set | LD06 | |||
常见问题Q&A
| Q1：油酸溶液的制备和加入细胞的方法 |
| A1：我们按照以下步骤制备和使用油酸溶液。 <油酸储存溶液> 必要的试剂 ·BSA(牛血清白蛋白) ·油酸 ·0.1 mol/l Tris-HCl(pH8.0) 制备步骤 1)在0.1 mol/l Tris-HCl（pH8.0）中加入BSA并溶解（BSA：浓度0.14 g/ml）。 2)在容器(一次性的离心管)中加入油酸后，加入步骤1）得到的BSA溶液，使用涡旋振荡器进行混合(油酸浓度：4 mmol/l)。*1 3)用孔径为0.22 µm的注射式过滤器(PTFE)过滤步骤2)的混合溶液。 4)每次使用后冷藏保存。*2 * 1 油酸和BSA溶液混合可能导致液体混浊，继续摇动让油酸和BSA形成复合物使混浊会消失。 * 2 将所需量的油酸储备溶液加入到实验使用的培养基中，用于将油酸加入到细胞中。 <加入细胞的方法> 1)将细胞在37℃ 5%CO2培养箱内培养24 h。 2)用加入了油酸储备溶液的培养基(油酸的终浓度200 µmol/L)替换，再培养24 h。 3)然后按照说明书对脂滴进行荧光染色观察。 |
| Q2：共染时推荐的荧光滤光片。 |
|
|
| Q3：检测不到荧光信号的应对方法是什么？ |
| Q4如果没有检测到荧光信号，可能会有几个因素。 请确认以下内容，并根据情况考虑优化条件。 1.激发·发射波长与染料的荧光特性不一致。 确认说明书上的荧光图谱和您仪器的激发和发射波长是否匹配。 2.染色条件不是最合适的。 [试剂浓度] 确认工作液的浓度是否在以下范围内。 Lipi-Blue，Lipi-Green：0.1-0.5μmol/l Lipi-Red：1-5μmol/l *如果在上述条件下仍未检测到荧光信号，请提高染色浓度。 Lipi-Blue，Lipi-Green：1-2μmol/l Lipi-Red：10-20μmol/l [染色时间] -一般是30min，如没有荧光信号可以延长染色时间至1-2 h。 3.固定条件不适合。 根据细胞种类不同，染色前后的固定操作可能会导致无法染色或灵敏度减弱。 在这种情况下，“请参考Q&A：是否可以对固定细胞进行染色？。 4.脂滴小，难以确认。 根据细胞的不同，可能会有脂滴很小难以确认的情况。 这种情况下，我们建议在高倍率的显微镜下确认，或用油酸处理细胞作为阳性对照进行评估。 |
| Q4：是否可以对固定细胞进行染色? |
| A4：可以染色，固定细胞的染色步骤有以下注意事项： ※请用多聚 甲醛 (PFA) 固定细胞，不建议用甲醇等醇类固定细胞，因为可能会影响脂滴的结构。 ※部分细胞种类染色后，如果在固定细胞过程中出现无染色或染色强度不够的情况，需要摸索最佳固定条件。 ○细胞染色后固定实验例 (以HepG2细胞为例) 1. 将HepG2细胞接种在µ-Slide 8孔板上，并在37℃ 5% CO2培养箱中过夜培养。 2. 去除培养基，用PBS清洗2次。 3. 在细胞中加入用PBS配制的Lipi工作液，在37℃培养箱中培养15 min。 4. 去除上清液，用PBS清洗2次。 5. 加入4% PFA (在PBS中)，在室温固定5 min。 6. 去除上清液，用PBS清洗后，在荧光显微镜下观察。 ○细胞染色前固定实验例 (以HeLa细胞为例) 1. 将HeLa细胞接种在µ-Slide 8孔板上，并在37℃ 5% CO2培养箱中过夜培养。 2. 去除培养基，用PBS清洗2次。 3. 加入4% PFA (在PBS中)，在室温固定5 min。 4. 去除上清液，用PBS清洗2次。 5. 在细胞中加入用PBS配制的Lipi工作液，在37℃培养箱中培养30 min。 6. 去除上清液，用PBS清洗后，在荧光显微镜下观察。 |
| Q5：Lipi-Green可以用流式细胞仪检测吗？ |
| A5：Lipi-Green不能用于流式，但Lipi-Blue或Lipi-Deep Red可以用。 我们还特别准备了可以便于定量检测的试剂盒。 产品名称 货号 |
参考文献
1) Y. Tatenaka, H. Kato, M. Ishiyama, K. Sasamoto, M. Shiga, H. Nishitoh and Y. Ueno, "Monitoring Lipid Droplet Dynamics in Living Cells by Using Fluorescent Probes", Biochemistry., 2019, DOI: 10.1021/acs.biochem.8b01071 .
2) M. Oka, N. Kobayashi, K. Matsumura, M. Nishio and K. Saeki, "Exogenous Cytokine-Free Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Classical Brown Adipocytes", Cells., 2019, 8, (4), 373.
Lipi-Red试剂 货号：LD03
脂滴检测（红色）
Lipi-Red
商品信息
储存条件：在冷暗处保存
运输条件：室温
特点：
● 高特异性脂滴定位
● 可进行组织脂滴成像
● 多种颜色可供选择
概述
Lipi系列探针是高脂肪亲脂性小分子探针，其在疏水环境例如脂滴中发出强荧光。活细胞和固定细胞中的脂滴都可以使用本试剂清楚地观察。
原理
脂滴(脂肪滴，Lipid droplets, LDs)由中性脂肪组成，主要包括甘油三酯和胆固醇酯，其外层被一层单层磷脂分子包裹。而且脂滴不仅在脂肪细胞中存在，在真核生物中也普遍存在。最 新的研究表明，以前认为脂滴仅是一个简单的脂质储存器，但最近的研究表明其在调节脂质代谢1)，自噬2)和细胞衰老3)等方面都起着重要作用，因此需要进一步详细地研究脂滴形成·成长·融合·分解的机制。Lipi系列探针是高脂肪亲油性小分子探针，可在疏水环境例如脂滴中发出强荧光。Lipi探针染色后，无须洗涤即可观察到脂滴。
1) T. Fujimoto et al., “Lipid droplets: a classic organelle with new outfits.” Histochem Cell Biol., 2008, 130(2), 263.
2) R. Singh et al., “Autophagy regulates lipid metabolism.” Nature, 2009, 458(7242), 1131.
3) M. Yokoyama et al., “Inhibition of endothelial p53 improves metabolic abnormalities related to dietary obesity.” Cell Reports, 2014, 7(5), 1691.
脂滴的染色例
在活细胞状态下，用油酸诱导HeLa细胞后，用不同颜色的Lipi系列荧光探针检测
检测条件：
* Lipi-Blue ：Ex：405 nm, Em：450–500 nm
* Lipi-Green：Ex：488 nm, Em：500–550 nm
* Lipi-Red：Ex：561 nm, Em：565–650 nm
* Lipi-Deep Red：Ex：640 nm, Em：650–700 nm
染色条件：
在HeLa细胞培养基中加入200 μmol/l油酸，过夜培养后，用PBS清洗细胞，并分别加入不同颜色的Lipi探针(Lipi-Blue/Green/Deep Red：0.1 μmol/l、Lipi-Red： 1 μmol/l) 染色15 min后观察。
如何制备油酸溶液
请参考Q&A“油酸溶液的制备和加入细胞的方法”。
与竞争品比较
Lipi系列荧光探针大幅度地改善了现有脂滴染色试剂存在的问题 (如选择性，滤波器的适应性，荧光滞留性)。而且 Lipi系列荧光探针也适用于多重染色实验，可选颜色更多。
| 同仁化学试剂 | 其他品牌（T公司） | ||||||
| Lipi-Blue | Lipi-Green | Lipi-Red | Lipi-Deep Red | Oil Red O (比色) |
Nile Red | 试剂B | |
| 活细胞染色 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 | × | 〇 | 〇 |
| 固定细胞染色 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 |
| 对脂肪滴的选择性 (低背景) |
〇 | 〇 | 〇 | 〇 | × | × | △ |
| 与其他试剂的共染色*1 | 〇 | 〇 | 〇*2 | 〇 | n.d. | ×*3 | 〇 |
| 活细胞内的滞留性(24h) | 〇 | 〇 | × | × | n.d. | × | × |
*1. 关于共染色时推荐的荧光滤光片，您可以参考网页下方Q&A“共染时推荐的荧光滤光片”。
*2. 与绿色荧光共染色时，推荐使用550 nm以下的绿色荧光滤光片。
*3. 用GFP的滤光片(500~540 nm)时会串色。
产品特点
特点1：与抗体检测方法高度相关
用4％PFA固定HepG2细胞后，用1 μmol/l Lipi-Red 染色。 然后在脂滴膜上用抗ADFP抗体荧光标记，免疫染色，该抗体可以特异性标记脂滴膜上的蛋白质 (Adipophilin; ADFP)。实验证明Lipi-Red 与脂滴上蛋白质ADFP的定位高度相关。
<检测条件>
Lipi-Red：Ex: 405 nm / Em: 450-500 nm，
抗ADFP抗体(Alexa Fluor 647)：Ex: 640 nm / Em: 650-700 nm
特点2：高特异性定位脂滴
在HeLa活细胞中加入油酸，并用1μmol/L Lipi-Red和100 nmol/l Nile Red（T公司）染色。该结果显示Nile Red会染上脂滴以外的其它细胞质。
<检测条件>
Lipi-Red： Ex: 561 nm / Em: 565 - 650 nm
Nile Red：Ex: 561 nm / Em: 565-650 nm
特点3：光谱范围更窄，不易串色(Lipi-Red vs Nile Red)
在单通道情况下，Lipi Red和Nile Red（T公司）染色HepG2会用G激发观察红色荧光。而在多重染色情况下，可能会用B激发观察绿色荧光，此时Nile Red会出现串色现象。
在用Lipi-Red染色的细胞中，确认了由于G激发引起的红色荧光，并且没有确认由于B激发引起的绿色荧光泄漏。 另一方面，在用尼罗红染色的细胞中，观察到由于G激发引起的红色荧光，但是由于B激发而观察到绿色荧光的泄漏。
特点4：荧光在细胞中的滞留时间长
分别用Lipi系列、Nile Red和市售的试剂B染色HepG2细胞，观察在培养30 min和24 h的荧光图像。
实验例
用Lipi系列染色3T3-L1前脂肪细胞，可以清楚地检测出脂肪细胞中的脂质。
<脂肪细胞染色实验例>
(1)将3T3-L1细胞(1.5x104cells/孔)接种在µ-Plate 96孔板（ibidi）的各孔中，并在37℃ 5% CO2培养箱内培养。
(2)按照常规方法诱导分化为脂肪细胞。
(3) 去除上清液，用DMEM（25 mmol/l葡萄糖, 10% FBS, 无酚红）洗涤两次。
(4)加入用DMEM（25 mmol/l葡萄糖，10％FBS，无酚红）制备的每种染料的工作溶液，并在37℃下培养24 h。
(5)用荧光显微镜观察。
※试剂浓度：各2.5 µmol/l
实验例2：脂肪组织的脂滴成像
用4%PFA固定小鼠肝脏脂肪组织(冰冻切片)后用Lipi系列染色，比较幼鼠(6周龄)和老年小鼠(31周龄)的脂滴成像图像，发现肝脏脂肪组织中的脂滴量有很大差异。
<组织样品的染色实验例>
(1)向小鼠肝脏脂肪组织(冰冻切片)中加入4%PFA(PBS)，在室温下静置5 min。
(2)用PBS清洗后，加入各浓度的Lipi系列working solution（PBS），在4℃下静置24 h。
(3)用PBS清洗后，用落射型荧光显微镜进行荧光观察。
※工作液浓度：2.5 µmol/l(Lipi-Blue、Lipi-Green、Lipi-Deep Red)、25 µmol/l(Lipi-Red)
实验例3：使用细胞成像仪进行定量分析
将油酸或Triacsin C(acyl-CoA synthetase抑制剂）分别加入到HepG2细胞中，并比较脂滴的变化。在分析中，我们使用共聚焦定量细胞成像仪(横河电机株式会社 CQ1)获得每个细胞脂滴数量和面积的数据。
脂肪滴和细胞核的成像
使用共聚焦定量细胞成像仪在617/73 nm处拍摄脂滴图像，在447/60 nm处拍摄细胞核图像，在分析软体CellPathfinder中识别单个脂滴和细胞核，并计算其数量和面积。
横河电机CQ1拍摄条件
使用板：96 well plate，物镜：20倍
激发波长 ：405 nm (DAPI)：)：蓝色、561 nm (Lipi-Red)： 红色
紫框线：细胞核、黄框线：脂滴
脂滴数量及面积的分析
根据细胞核和脂滴的检测数据，每个细胞的脂滴的数量和面积如图所示。结果，加入油酸的脂滴增加了7-13倍，而加入Triacsin C抑制了脂滴的形成，脂滴数量减少到Control组的60%。
细胞处理及脂滴染色条件
将HepG2细胞(1x103cells)接种到96孔板中过夜培养。除去培养上清液后，加入未处理（仅含FBS的DMEM培养基）、油酸（含200 μmol/l油酸和FBS的DMEM培养基）或Triacsin C（含5 μmol/l Triacsin C和FBS的DMEM培养基）过夜培养。之后用PBS 清洗2次，用4%的PFA在室温下固定5 min后，用PBS 清洗2次。最后，加入1 μmol/l Lipi-Red working solution 在室温、避光下染色2 h后，用共聚焦定量细胞成像仪进行定量分析。
Lipi系列荧光图谱
脂肪滴产品种类的检测方法
| 产品名称 | 规格 | 货号 | |||
| 成像(成像) 脂滴荧光探针 |
Lipi-Blue | 10 nmol | LD01 | ||
| Lipi-Green | 10 nmol | LD02 | |||
| Lipi-Red | 100 nmol | LD03 | |||
| Lipi-Deep Red | 10 nmol | LD04 | |||
| 定量（荧光酶标仪，FCM） 脂滴荧光检测试剂盒 |
Lipid Droplet Assay Kit - Blue | 1 set | LD05 | ||
| Lipid Droplet Assay Kit - Deep Red | 1 set | LD06 | |||
常见问题Q&A
| Q1：油酸溶液的制备和加入细胞的方法 |
| A1：我们按照以下步骤制备和使用油酸溶液。 <油酸储存溶液> 必要的试剂 ·BSA(牛血清白蛋白) ·油酸 ·0.1 mol/l Tris-HCl(pH8.0) 制备步骤 1)在0.1 mol/l Tris-HCl（pH8.0）中加入BSA并溶解（BSA：浓度0.14 g/ml）。 2)在容器(一次性的离心管)中加入油酸后，加入步骤1）得到的BSA溶液，使用涡旋振荡器进行混合(油酸浓度：4 mmol/l)。*1 3)用孔径为0.22 µm的注射式过滤器(PTFE)过滤步骤2)的混合溶液。 4)每次使用后冷藏保存。*2 * 1 油酸和BSA溶液混合可能导致液体混浊，继续摇动让油酸和BSA形成复合物使混浊会消失。 * 2 将所需量的油酸储备溶液加入到实验使用的培养基中，用于将油酸加入到细胞中。 <加入细胞的方法> 1)将细胞在37℃ 5%CO2培养箱内培养24 h。 2)用加入了油酸储备溶液的培养基(油酸的终浓度200 µmol/L)替换，再培养24 h。 3)然后按照说明书对脂滴进行荧光染色观察。 |
| Q2：共染时推荐的荧光滤光片。 |
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| Q3：检测不到荧光信号的应对方法是什么？ |
| Q4如果没有检测到荧光信号，可能会有几个因素。 请确认以下内容，并根据情况考虑优化条件。 1.激发·发射波长与染料的荧光特性不一致。 确认说明书上的荧光图谱和您仪器的激发和发射波长是否匹配。 |
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