E1A残留DNA（qPCR）检测试剂盒价格_品牌:爱必信(absin)-丁香通官网

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保质期：试剂盒应在-20℃条件下保存，有效期为 12 个月。开封后未使用完的试剂盒注意仍在规定储存条件下保存。

供应商：爱必信(上海)生物科技有限公司

保存条件：试剂盒应在-20℃条件下保存，有效期为 12 个月。开封后未使用完的试剂盒注意仍在规定储存条件下保存。

规格：100T

概述

描述

FDA提醒使用HEK293T细胞生产病毒载体时除应检测SV40 LTA抗原序列，还需要检测残留的腺病毒E1A 序列。CDE 2022年5月颁布的《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则》也提到，如使用HEK293T细胞进行病毒载体生产，需进行SV40大T抗原DNA残留、E1A基因DNA残留检测。
E1A残留DNA（qPCR）检测试剂盒可用于定量检测生物制品中宿主细胞，如 HEK293、293T 细胞等来源的 E1A 残留 DNA量的专用试剂盒，具有专一性强，灵敏度高等特点，可以快速、特异地检测半成品、中间品以及成品中E1A DNA残留。本试剂盒与细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒配套使用，可准确定量样品中残留的微量 E1A DNA。
建议所有使用该试剂盒的实验室按需可做以下验证：标准品线性、样本线性、准确度（加标回收率）、定量限、精密度(重复性)、分析特异性以及阴性参考品符合率。
样本线性：依据 YY/T 1182-2020 的相关要求，在线性范围内，取接近线性范围上限的高值样本按一定比例（如 5 倍或 10 倍）稀释为至少 5 种浓度，其中低值浓度样本须接近线性范围的下限，将每一浓度样本检测 1 次或多次，计算每一浓度的对数均值和稀释比例(或理论浓度)的对数值，以浓度的对数均值为 Y，稀释比例(或理论浓度)的对数值为 X 进行线性拟合，计算其线性相关系数 r。
分析特异性验证：验证需避免工艺杂质对检测结果的干扰，必要时可对样本进行核酸提取纯化。为避免基质干扰和保证检测有效性建议使用纯度较高的 DNA 进行相应稀释后来做验证。
精密度/定量限：验证时，如需同时配制标曲，需控制 CV，避免重复操作过多，CV 偏大影响标曲建立和精密度/定量限验证。
数据分析：由于仪器不同，数据阈值线会存在区别，故在数据分析时需依据实际情况统一阈值线再进行数据分析比较。
样本核酸提取纯化：可与“宿主细胞残留 DNA（磁珠法）样本前处理试剂盒”配合使用。该试剂盒主要用于生物制品样本中微量核酸的提取，可精准抽提各种生物制品中宿主细胞残留 DNA，适用于多种基质缓冲溶液，可有效提取纯化微量的 DNA。
产品特点：
精密度高：低浓度重复性CV值<20%；中高浓度重复性CV值<15%
灵敏度高：定量限为40 copies/μL
快速高效：检测快速，一小时即可出结果
产品性能指标：
线性范围：4×10⁶ copies/µL~4×10¹ copies/µL。
标准品线性：R2≥0.980，扩增效率 90%≤Eff（%）≤110%，各浓度检测值 CV<15%。
准确度（加标回收率）：70%-130%。
定量限：4×10¹ copies/µL，CV≤20%，测量偏差不大于|±20%|。
精密度(重复性)：高、中两个浓度参考品各 10次，变异系数CV<15%。
分析特异性：考察生物制品生产中常用的 DNA 对检测试剂盒的干扰，干扰组应与对照组重合，未见干扰。
阴性参考品符合率：NTC 为 Undetermined 或 Ct 值>35。
适用机型（包括但不限于）：ABI QuantStudio 3，ABI 7500，Bio-Rad CFX Opus96 等。
冻融稳定性：5 次以上。

检验原理

依据《美国药典》<509>通则和<1130>以及《中国药典》通则<3407> 中的各种检测方法，最终选择更准确、可靠、科学的荧光探针（TaqMan ®）qPCR 法作为细胞残留 DNA 检测的方法。TaqMan ®荧光探针是一种寡核苷酸探针，其 5’末端携带荧光基团（报告基团），如 FAM、TET、VIC等，3’端携带淬灭基团，如 TAMRA、BHQ1 等。PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一条特异性的荧光探针，探针完整时，荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。PCR 扩增时，Taq 酶的 5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统（荧光定量 PCR 仪）可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。该方法具有特异性强、灵敏度高等特点，在目前生物制药细胞核酸残留检测中被广泛使用。

产品组成

编号	组成	规格	储存条件
1	E1A Primer&Probe MIX	550µL	-20℃避光保存
2	2×qPCR Reaction MIX	1.6mL	-20℃
3	线性化 DNA 定量参考品（4×10⁸copies/µL）	50µL	-20℃
4	DNA稀释液	1.5mL×3	-20℃

用途说明

E1A 残留 DNA（qPCR）检测试剂盒具有专一性强，灵敏度高等特点，可以快速、特异地定量检测生物制品半成品、中间品以及原液和成品中宿主细胞（如 HEK293、293T 细胞等）中 E1A 和 SV40LTA DNA 残留的专用试剂盒。

使用方法

一、准备工作：
1、试剂盒准备：
将试剂盒各组分置于冰上或 4℃，确保充分溶解后开始操作。
2、需自备的耗材及设备：
（1）荧光定量 PCR 仪、涡旋仪、离心机
（2）高精度移液器及一次性无菌无酶低吸附带滤芯吸头（0.5-10µL、10-100µL、20-200µL、100-1000µL）
（3）1.5mL 无菌无酶低吸附离心管
（4）无菌无酶八联管或 96 孔 qPCR 板
二、操作流程：
1、操作详细步骤：
（1）qPCR 反应液的制备：
①根据所需检测的参考品和待测样品数量（一般做 3 组复孔），分别计算反应所需孔数：
反应孔数=（参考品 ST1-6+1 个无模板对照 NTC+待测样品）×3
②根据反应孔数计算本次所需的 qPCR MIX 总量：
qPCR MIX =（反应孔数+2 或 3）×15μL（2×qPCR Reaction MIX）+
（反应孔数+2 或 3）×5μL（E1A Primer&Probe MIX）（2 或 3 为操作损失量）
③将所用试剂置于冰上完全溶解，轻微振荡混匀，瞬时离心，按下表所示配制：
表 2 qPCR MIX 配制表

组分	单个反应量
2×qPCR Reaction MIX	15μL
E1A Primer&Probe MIX	5μL
总体积	20μL

④将配制的 qPCR MIX，轻微振荡混匀，瞬时离心，按 20μL/孔分装至八联管或者 96 孔板中。
⑤将DNA稀释液按10μL/孔加到分装了 qPCR MIX 八联管或者 96 孔板中，具体加样见表 4。
（2）定量参考品的稀释：
（注：根据试剂盒提供的标准品按照需求配制）
用试剂盒提供的DNA稀释液将DNA定量参考品（4×10⁸copies/µL）系列倍比（稀释倍数：10倍）稀释，稀释浓度依次为4×10⁷copies/µL，4×10⁶copies/µL，4×10⁵copies/µL，4×10⁴copies/µL，4×10³copies/µL，4×10²copies/µL，4×10¹copies/µL。具体步骤如下：
①将试剂盒中的 DNA 定量参考品和 DNA 稀释液置于冰上或 2-8℃条件下融化。待完全溶解后，轻微振荡混匀，离心 3~5 s。
②取干净的 1.5 mL 离心管，分别标记为 ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5，ST6。
③在 ST0 管中用 DNA 稀释液将 DNA 定量参考品（4×10⁸copies/µL）稀释至 4×10⁷copies/µL，轻微振荡混匀，离心 3~5 s。确保 DNA 定量参考品与DNA 稀释液充分混匀，使用时避免反复冻融。
④在 ST1，ST2，ST3，ST4，ST5，ST6管中分别加入 90μL DNA 稀释液，再进行梯度稀释，稀释方法如下所示：
表 3 DNA 定量参考品的稀释

稀释管	稀释体积	终浓度（copies/µL）
ST1	10 μL ST0+90 μL DNA 稀释液	4×10⁶
ST2	10 μL ST1+90 μL DNA 稀释液	4×10⁵
ST3	10 μL ST2+90 μL DNA 稀释液	4×10⁴
ST4	10 μL ST3+90 μL DNA 稀释液	4×10³
ST5	10 μL ST4+90 μL DNA 稀释液	4×10²
ST6	10 μL ST5+90 μL DNA 稀释液	4×10¹

【注】：标准曲线浓度点可根据实际验证结果进行选择，应至少包含 5 个浓度点。
已融化未使用的 DNA 稀释液可在 2-8℃短暂保存，若长期不使用，请储存于-20℃。稀释方法可根据实验需要进行调整。
（3）qPCR 加样：
①将所需试剂置于冰上操作，轻微振荡混匀，瞬时离心，加样（总体积 30μL）：
表 4 MIX 各反应孔加样示例

参考品	参考品 ST1-6 各 10μL+所需 qPCR MIX 量 20μL
无模板对照NTC	DNA 稀释液各 10μL+所需 qPCR MIX 量 20μL
待测样品	待测样品各 10μL+所需 qPCR MIX 量 20μL

②实验可使用无菌无酶的八联管或者 96 孔板进行反应，需去除反应体系中的气泡，并离心至管底准备反应。
（4）qPCR 反应程序参数设置：
以美国 ABI 7500 Real-Time PCR System、软件版本 2.06 为例。
1)在Experiment Propertie s 页面创建空白新程序如图所示：

①Experiment name：修改实验名称。
②Experiment type：选择程序（Quantitation-Standard Curve）。
③Reagents：选择实验方法（TaqMan ® Reagents ）。
2)创建该产品检测探针，选择①界面，点击②创建探针，在TargetName中编辑探针名称并命名，在Reporter③和Quencher④中选择所需的荧光基团和淬灭基团。本产品荧光基团选择FAM，淬灭基团为None，参比荧光为ROX。点击⑤创建样品，在相应的Samplename⑥一栏中命名样品的名称。

3) 在 Plate Setup ①界面，将标准曲线孔在 Task② 一栏设置为“S”③，并且在 Quantity④一栏分别赋值设为 4×10⁶，4×10⁵，4×10⁴，4×103，4×10^2，4×10¹（单位为copies/µL），并且在相应的 Sample name 一栏中命名为ST1，ST2，ST3，ST4，ST5，ST6。在 Plate Setup ①界面中，将无模板对照 NTC 孔在 Task②一栏设置为“N”⑤，将待测样本孔在Task②一栏设置为“U”⑥，并且在相应的 Sample name 一栏中命名样品的名称。（图例仅供参考）

4) 设置反应程序：

Stage1	污染消化	Reps：1	50℃	2min	程序中 60℃ 30s 处设置为荧光收集①；反应体积 30μL。
Stage2	预变性	Reps：1	95℃	20s
Stage3	循环反应	Reps：40	95℃	3s
Stage3	循环反应	Reps：40	60℃	30s

5) 点击 Run 界面的 “Start Run”按钮进行 PCR 测定。

三、结果分析：
以美国 ABI 7500 Real-Time PCR System、软件版本 2.06 为例。
1、在 Analysis 的 Amplification Plot①面板中，点击 Reanalyse②，初步查看扩增曲线的形态是否正常。在 Analysis 的 Standard Curve③面板中，可读取标准曲线的斜率（Slope）、R 2和扩增效率（Eff%）④等。在 Analysis 的 View Well Table⑤面板中，Quantity Mean 一栏可读取待测样本的检测值，单位为copies/µL。（图例仅供参考）

2、结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本，一般也可由仪器自动判读。

性能

储存/保存方法

试剂盒应在-20℃条件下保存，有效期为 12 个月。开封后未使用完的试剂盒注意仍在规定储存条件下保存。

注意事项

1、本试剂盒已通过稳定性（冻融等因素）的验证，无需分装。
2、阴性样品（2×qPCR Reaction MIX、Primer&Probe MIX 和 DNA稀释液等）和阳性样品（参考品和待测样品等）的配制和加样环境需区分区域，不可在一个区域内操作，配制人员需穿戴整齐，戴好口罩、手套和穿好洁净服。
3、注意在不同加样步骤间及时更换吸头，避免交叉污染，避免长时开盖，使用移液器移液时，需避免液体挂壁。
4、试剂盒必须在有效期内使用，每次实验均需重新制备相应的标准曲线，不建议不同标准曲线之间混用，不建议不同批次的相关试剂混用。
5、试剂盒内所有组分建议在低温环境融化后使用，且需确保其充分溶解，各组分使用前需充分混匀，以保证试剂的均一性，经混匀的试剂需经短暂离心，以使管壁及盖子上的液体全部集中于管底。若发现DNA 稀释液中有析出物，建议于 37 ℃条件下进行孵育，使 DNA 稀释液完全溶解。
6、只有严格遵守说明书的操作方法，全部使用本试剂盒配套的试剂才能保证最佳检测效果。
7、最终的试验结果与试剂的有效性、操作者的操作方法及试验环境密切相关。
8、公司只对试剂盒本身负责，不对因使用该试剂盒所造成的样本消耗负责，请使用者使用前充分考虑到样本的可能使用量，预留充足的样本。