文献支持活性氧ROS荧光探针 DCFH-DA 4091-99-0

保存条件 ：RT/2-8℃/-20℃

保质期 ：3年

英文名 ：DCFH-DA

库存 ：999

供应商 ：北京康瑞纳生物科技有限公司

CAS号 ：4091-99-0

规格 ：25mg

活性氧ROS荧光探针 DCFH-DA 4091-99-0 活性氧ROS荧光探针 DCFH-DA 4091-99-0
产品名称：活性氧ROS荧光探针 DCFH-DA 4091-99-0
产品编号：A1714
中文别称 活性氧ROS荧光探针；DCFH-DA 二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯；2',7'-二氯荧光素二乙酸酯
英文别称 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate
CAS 4091-99-0
分子式 C24H16Cl2O7
分子量 487.28
储存条件 -20℃
有效期 1年
溶解性 溶于DMSO
纯度 ≥97%
包装 瓶
规格 25mg 100mg

DCFH-DA 本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而 DCFH 不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH 生成有荧光的DCF 。检测DCF 的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

操作步骤（仅供参考）：

一、制备探针：10mM（4.8729mg溶于1mL DMSO）

二、装载探针：

对于刺激时间较短（通常为2 小时以内）的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长（通常为6 小时以上）的细胞，先用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。

原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1 ∶1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10μ mol/L。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA不少于1mL 。37℃细胞培养箱内孵育20 分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20～30分钟后可以显著提高活性氧水平。

收集细胞后装载探针：按照1 ∶1000 用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10μmol/L。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为一百万至二千万/mL ，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3 ～5 分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20～30分钟后可以显著提高活性氧水平。

三、检测：

对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，也可以用激光共聚焦显微镜直接观察。

四、参数设置

使用488nm 激发波长，525nm 发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF 的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF 。

注意事项：

1. 探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

2. 探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。DCF 的激发光谱和发射光谱请参考上图。

3. 尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。

4. 对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1 ∶2000～1 ∶5000稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA的浓度为2～5μmol/L。探针装载的时间也可以根据情况在15～60分钟内适当进行调整。

5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
 

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