试剂盒组分、操作步骤等更多细节请查看zuixinban说明书

1.实验全程如何预防RNA降解？

实验使用的所有试剂耗材需经过去RNA酶处理。

 

2.RNA pull-down⼀定要体外转录合成RNA探针吗？

体外转录只是获得RNA的⼀种方式，相比化学合成纯度更高。所以pull-down实验⼀般是体外转录得到目的RNA。当目的RNA序列大于2000bp时体外转录就不太容易转录成功了,这时我们可以利用设计合成⼀小段目的RNA探针,通过探针与目的RNA结合,再与蛋白结合,便可绕过这个问题。

 

3.RNA在转录出来后，其OD⼀般都不高，可以使用吗？咋定量呢？

OD值不高可进行RNA纯化，即便不纯化在实验中多加⼀些RNA亦可。而定量问题⼀般会进行琼脂糖凝胶电泳检测，可以根据marker浓度来判断RNA的浓度。也⽤仪器测量RNA的浓度，但通过体外转录得到的RNA浓度都能达到2μg/μL以上。并且pull-down实验不需要多精确的定量，都会加入过量的探针。

 

4.关于样本处理：细胞裂解物裂解的时候要不要加蛋白酶抑制剂还有RNA酶抑制剂这些处理？细胞裂解物提取蛋白是要怎么处理？还是就是裂解细胞就行了？

细胞裂解需要加入蛋白酶和RNA酶抑制剂，最好能够进行超声处理。另外裂解蛋白的全程尽量在冰上操作。

 

5.lncRNA引物设计有什么注意事项么？或者说与普通的引物设计有什么区别么？

体外转录扩增的引物只需要在正向引物5端加⼊T7启动子序列即可。

 

6.想问下有推荐的银染试剂盒么？

赛默飞或者我们金开瑞的都可以。

 

7.质谱鉴定的蛋白主要是依据打分来进行筛选？

这个筛选多少分算有效？pull-down富集蛋白质谱分析后会剔除不可信蛋白，交付的都是可信蛋白，没有明确的打分。需要排序的话⼀般是根据鉴定蛋白特征性肽段的数目作为参考。

 

8.做lncRNA pull down+质谱⼀般会发现多个互作蛋白对吗？

对这多个蛋白，如何选择就哪⼀种继续研究下去？ 不同的RNA结合蛋白数量不等，根据实际鉴定的蛋白进行筛选；筛选的原则是根据自己研究的方向或相关功能确定这类蛋白。