云序生物绝对定量RNA测序技术价格

转录组分析的核心目标是准确定量样品中RNA转录本的丰度。

RNA-seq的流程为：RNA片段化→cDNA合成→加接头→PCR扩增→测序。但由于在进行RNA测序时，逆转录、加接头、PCR文库扩增、测序序列依赖性偏差和扩增噪声等原因，使得常规RNA-Seq的结果准确度下降。

2012年PNAS报道了一种可以降低RNA-Seq偏倚和噪音的方法，也是我们常说的UMI-RNA-Seq。

RNA测序在文库构建时，都需要通过PCR扩增，产生重复的分子片段，但是所有的文库片段并非以同等速率等量的扩增，扩增速率受到片段长度、GC含量、片段浓度等多方面的影响，容易扩增的片段被极大的富集，一些含量较低的片段或碱基偏好严重的片段甚至完全丢失，最终影响测序结果的准确性。

UMI-RNA-Seq是在每个cDNA分子扩增之前连接特异序列标签（UMI，Unique Molecular Identifier），这些标签（UMI）会随cDNA序列一起扩增测序。测序完成后，通过识别UMI标签，将具有相同数字标签的重复片段合并，消除PCR扩增中的偏好性（去除PCR扩增及测序仪引起的重复），就可以定量原始样本中cDNA分子的数量。

UMI消除PCR扩增偏好，但UMI≠绝对定量测序！

相比常规转录组测序，通过添加UMI特异性标签，转录本测序定量的准确性确实能够实现大幅提高，但通过UMI-RNA-Seq就能真正的实现绝对定量测序吗？

根据上述UMI-RNA-Seq的原理，我们可以发现UMI特异标签能够很好的消除文库构建过程中PCR扩增及测序仪引起的偏好性和重复性。但在测序过程中不止PCR扩增过程会产生干扰，逆转录突变、建库过程技术误差、测序数据量差异等都会导致转录组测序准确性下降，因此仅仅通过UMI标签不能完全消除这些差异，无法实现真正意义上的绝对定量测序。

云序生物UMI + spike-in矫正实现更精准定量测序！！

为了弥补UMI-RNA-Seq方法无法消除的逆转录突变、试验技术误差、测序结果数据量差异等缺点，云序生物联合UMI-RNA-Seq与spike-in矫正共同实现对转录组测序的精准绝对定量！

Spike-in是什么？

Spike in标准物，也称为外源性内标，是指在每个样品中加入等量的已知序列信息的非亲缘标准品基因组，与实验样品共同进行文库构建，这样在进行RNA-Seq测序时就可以通过不同样本之间内参（spike-in）量，非常准确地对不同样本之间的表达量进行矫正，很好的弥补UMI无法消除的偏差，从而实现测序高准确性定量。

a. 当基因组各处都发生相同程度的变化时，将总测序reads归一化为相同的数字会隐藏变化，而将spike-in的reads归一化为相同的数字会揭示reads密度的全局变化。
b. 当特定基因组区域发生信号增加时，标准化样本之间的总测序reads会导致来自基因组其他区域的reads数量人为减少，这就会错误地解释为在特定实验条件下减少。而通过使用spike-in的reads作为标准化，可以避免这种人为的变化。

技术优势