研选外泌体RT-PCR实验

提供商 ：上海研匠生物科技有限公司

服务名称 ：外泌体RT-PCR实验

规格 ：/样本

1. 做外泌体RT-PCR背景和意义：

外泌体是由细胞分泌的包含 RNA 和蛋白质的小囊泡(30～150 nm),它可将源自亲代细胞的特定物质递送至疾病发展相关的受体细胞,因此一直被认为可作为疾病进展的潜在生物标志物用于诊断,但具体机制仍不清楚。

外泌体 RNA 作为癌症诊断标志物是否可行

CircLPAR1 是外泌体中的环状 RNA 分子,在结直肠癌(CRC)患者血浆外泌体中会发生显著变化。南京医科大学团队在 Molecular cancer 发文[1],通过对 CRC 特异性的外泌体 circRNA 进行鉴定和富集,最后使用 qPCR 检测后进行功能评估。本研究对血浆外泌体 circLPAR1 可作为 CRC 高灵敏早期诊断标志物提供了新的证据。

qPCR 检测外泌体是强强联手还是无稽之谈?

我们也许会有疑问:外泌体本来就少,提取的 RNA 就更少,后续做 qPCR 检测岂不是难上加难?想知道 qPCR 检测外泌体是否具有合理性,我们需要先了解如何进行这项实验。

2. 实验过程:

(1)外泌体提取

包括研匠在内的很多公司都有针对各种不同样本的外泌体提取试剂盒，但是我们优先推荐超高速离心外泌体，这个是外泌体提取的金标准。样本预处理阶段很重要,甚至决定了后续提取外泌体的纯度和量。

(2)RNA 提取

外泌体 RNA 可以用专用的外泌体 RNA 提取试剂盒提取,也可以用 Trizol 法提取,建议 Trizol 与外泌体的体积比不小于 4:1(也可以用 Trizol 直接裂解外泌体沉淀)。

具体操作:取 200 μl 外泌体于 1.5 ml EP 管中,加入 800 μl Trizol 试剂,充分混合,裂解 10 min,12000 rpm 离心 10 min 取上清。

(3)反转录

采用 全式金预混型快速逆转录试剂盒:适用于长片段 RNA(如 mRNA、LncRNA 等)、miRNA 加尾法逆转录试剂盒做反转录:适用于短片段 RNA(主要为 miRNA)的加尾法。

(4)qPCR 检测

采用 全式金 2×SYBR Green qPCR 试剂，适用于 ABI 7500 等设备。

(5)数据分析:采用仪器自带的 QPCR 分析软件进行数据分析

可以看到 qPCR 检测外泌体可行且可靠,但实验过程并不简单,因此我们对经常会遇到的问题及解答也进行了整理,帮助大家更好的完成实验。

qPCR检测外泌常见问题及解决方法

1. 外泌体 RNA 如何提取?

外泌体 RNA 可以用专用的外泌体 RNA 提取试剂盒提取,也可以用 Trizol 法提取,建议 Trizol 与外泌体的体积比不小于 4:1(也可以用 Trizol 直接裂解外泌体沉淀)。

2. 外泌体 RNA 如何定量?

外泌体 RNA 含量很低,不建议使用微量紫外分光光度计定量,可以使用 Agilent 2100 生物分析仪等定量,也可以直接按最大体积进行逆转录实验。

3. 外泌体做 qPCR 检测应该选什么参照?

外泌体没有通用的内参选择,可以使用外参(cel-miR-39)作为参照。

4. 外泌体多样本进行 qPCR 检测时,扩增曲线和溶解曲线有差异,是否正常?

一般来说属于正常现象,由于外泌体不像细胞或者组织来源稳定,不同外泌体样本及处理的差异,可能导致外泌体里核酸含量及片段大小不同,会产生扩增曲线或溶解曲线的差异。

5. 外泌体 qPCR 检测 CT 值较大是否正常?

属于正常现象,由于外泌体 RNA 含量较低,特别是一些低丰度的基因 CT 值会较大,可以选择高效的反转录及 PCR 试剂。

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