人血管性血友病因子(VWF)ELISA试剂盒

样本 ：Human

标记物 ：人

适应物种 ：Human

应用 ：用于人血清、血浆或其他相关生物液体中Agouti相关蛋白的测定

检测方法 ：双抗体夹心法酶联免疫吸附检测技术

检测限 ：7.81-500 pg/mL

库存 ：96 TESTS

供应商 ：FLIGHT

规格 ：48TESTS/96TESTS

工作原理

 

本试剂盒采用的是双抗夹心酶联免疫吸附检测技术（ELISA）。测定样品中人 Agouti 相关蛋白水平。向 预先包被了抗人 Agouti 相关蛋白抗体的酶标孔中，加入标准品和样本，温育后，加入生物素标记的抗 Agouti 相关蛋白抗体。再与 HRP 标记的链霉亲和素结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结 合的酶，然后加入显色底物 TMB，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。最后，在 450 nm 处测 定反应孔样品吸光度（OD）值，样本中的人 Agouti 相关蛋白浓度与 OD 值成正比，通过绘制标准曲线计 算出样本中人 Agouti 相关蛋白的浓度。
 

需要而未提供的试剂和器材

1.37°C 恒温箱
2.酶标仪（450 nm 波长滤光片）
3.精密移液器及一次性吸头
4.去离子水或蒸馏水
5.一次性试管
6.洗板机或洗瓶，吸水纸
 

注意事项

1.试剂盒应在有效期内使用，请不要使用过期的试剂。不同批次的试剂盒组分不能混用。
2.试剂盒未使用时应按各组分标签温度分开保存。
3.试剂盒使用前请在室温恢复 20 min，且充分混匀试剂盒里的各种成份及制备的样品。
4.在试验中标准品和样本建议作复孔检测，且加入试剂的顺序应保持一致。
5.为避免交叉污染，请在试验中使用 1 次性试管，枪头，封板膜及洁净塑料容器。
6.浓缩生物素标记抗体和浓缩 HRP 标记链霉亲和素的体积较少，在运输过程中微量液体会沾到管 壁及瓶盖上，使用前请离心处理（5-10 s 即可），使管壁上的液体集中在管底部，取用时，请用 移液器小心吹打几次。
7.为保证结果准确，每次检测均需做标准曲线。请勿重复使用已稀释过的标准品、浓缩生物素标 记抗体、浓缩 HRP 标记链霉亲和素。
8. 试剂盒中的终止液为酸性溶液，操作人员在使用时请带上手套并注意防护；在操作过程中也要避免试剂接触皮肤和眼睛，如果不慎接触，请用大量清水清洗；检测血液样本及其它体液样本 时，请按国家生物实验室安全防护有关管理规定执行。

操作程序
※正式测定前请务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。
1.预先计算好所需的板条数，实验前 30 min，拿出试剂盒，恢复至室温。
2.每个反应孔中加入 100 μl 标准品工作液及检测样本（若样本浓度高于检测范围，需用标准品&样 本稀释液稀释后取样），标准品需做复孔，封板后于 37°C 孵箱孵育 90 min。 提示：加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，避免产生气泡。加样 时间控制在 10 min 内。
3.弃去液体，甩干，每个反应孔中加入 100 μl 生物素标记 Agouti 相关蛋白抗体工作液至反应孔中， 封板后于 37°C 孵箱孵育 60 min。
4. 洗涤：弃去液体，甩干，每个反应孔中加入 350 μl 洗涤液，浸泡 1-2 min，甩干洗涤液。重复 4 次。
5. 每个反应孔中加入 100 μl HRP 标记链霉亲和素工作液至反应孔中，封板后于 37°C 孵箱孵育 30 min。
6. 洗涤：每个反应孔中加入 300 μl 洗涤液，间隔 30 s，甩干洗涤液。重复 4 次。
7. 每个反应孔中加入 90 μl 显色剂（避光）至反应孔中，封板后于 37°C 避光显色 15 min 左右。
8. 每个反应孔中加入 50 μl 终止液，即刻用酶标仪 450 nm 波长下测量 OD 值（5 min 内）。
9. 用酶标仪 450 nm 波长测定 OD 值。
10. 计算标准品、样品的平均 OD 值：每个标准品和样本的 OD 值应减去零孔的 OD 值。
11. 以标准品浓度为横坐标，吸光度 OD 值为纵坐标，用“四参数 logistics 模型”绘制标准曲线。 （作图时去掉空白组的值）
12. 若样本 OD 值高于标准曲线上限，应做适当稀释后重新检测，计算浓度时再乘以稀释倍数。