流式细胞检测

提供商 ：浙江亦高生物科技有限公司

服务名称 ：流式细胞检测

一、简介
1、概念
PI单染色法
主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细
胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面:
1.细胞核的改变:由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。研究表明，用各种染
色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标
志之一。
2.光散射特性:凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光
反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一
特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞
侧散射光常增加。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大;侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧
散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的
均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，
其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用
以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。
2、细胞调亡的特征
形态学观察细胞凋亡的变化是多阶段的，细胞凋亡往往涉及单个细胞，即便是一小部分细胞也是非同步发生的。首先出现的
是细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素
C到胞浆，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解成为约180bp-200bp片段;胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到
膜表面，胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个凋亡小体，无内容物外溢，因此不引起周围的炎症反
应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。
细胞生物化学变化
DNA的片段化
细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体的DNA降解，这是一个较普遍的现象。
这种降解非常特异并有规律，所产生的不同长度的DNA片段约为180-200bp的整倍数，而这正好是缠绕组蛋白寡聚体的长
度，提示染色体DNA恰好是在核小体与核小体的连接部位被切断，产生不同长度的赛聚核小体片段，实验证明，这种DNA
的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果，该酶在核小体连接部位切断染色体DNA，这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳
中就呈现特异的梯状Ladder图谱，而坏死呈弥漫的连续图谱。
2)大分子合成
细胞凋亡的生化改变不仅仅是DNA的有控降解，在细胞凋亡的过程中往往还有新的基因的表达和某些生物大分子的合成作为
调控因子。如我们实验室发现的TFAR-19就是在细胞凋亡时高表达一种分子，再如在糖皮质激素诱导鼠胸腺细胞凋亡过程
中，加入RNA合成抑制剂或蛋白质合成抑制剂即能抑制细胞凋亡的发生。

       
流式检测细胞调亡
形态学
可间接观察调亡细胞形态学变化，主要是根据未经染色的调亡细胞的光散射特征进行检测。
FCM提供的散射光参数主要包括前向散射光(FSC)和测向散射光(SSC)。FSC主要与细胞大小有关，对同一个细胞群
体，射散光强的，其细胞大一些，散射光弱的，其细胞小一些。SSC主要与细胞内部颗粒密度有关，颗粒密度越大。SSC就
越大，而颗粒密度越小，SSC就越小
此外，也可通过FSC区分坏死细胞和调亡细胞。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其FSC增大，SSC在细胞坏死时也增大。但晚
期调亡的FSC和SSC与坏死细胞区分不明显。当坏死细胞的细胞膜破裂，核质丢失，细胞成为碎片时，其FSC和SSC均明显
变小。
细胞对染料吸收能力的检测
调亡细胞的一个重要特点是很长一段时间里细胞膜结构未受影响，其主要表现为:维持膜的基本功能，如离子和大分子的屏
蔽作用和具有功能的通道泵。
根据不同功能状态下的细胞对染料的吸收或排斥作用不同，可用流式细胞以定量检测活细胞、调亡细胞和坏死细胞的百分比。
三、简要的实验步骤
1.收集细胞{数目约(1~5)x106个/mL}，500~1000r/min离心5min，弃去养液。
2.3miP洗涤1次。
3.离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃，1-2小时。
4.离心弃去固定液，3mlPBS重悬5min，
5.400目的筛网过滤1次，500-1000r/min离心5min，弃去PBS。
6.用1mlPI染液染色，4℃避光30min，
7.流式细胞仪检测:PI用氢离子激发荧光，激光光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光分析PI荧光强
度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。
8.结果判断:在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上，凋亡细胞与正常细胞相比，前散射光降低，而侧散射光可高可
低，与细胞的类型有关;在分析PI荧光的直方图时，先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片，在PI荧
光的直方图上，凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体峰。如以G1/G0期所在位置的荧光强度为1.0，则一个典型的凋亡细
胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为0.45，可用鸡和鲑鱼的红细胞的PI荧光强度做参照标准，两者分别为0.35和0.7，可以确
保在两者之间的不是细胞碎片而是完整的细胞。
注意事项
细胞凋亡时，其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低，或
者是因为DNA
结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。
四、部分实例展示