高难度PCR，SNP，定点突变，启动子筛选

提供商 ：武汉柏迈德生物

服务名称 ：高难度PCR，克隆，测序，SNP，定点突变，启动子筛选

我公司实验中心有分子生物学平台、细胞实验平台、光镜平台、植物组培平台、原核蛋白表达平台、同工酶实验室、组培室。可以设计、开展各类动物、植物、细菌、细胞、分子等生物实验。
长期承接难度高的荧光定量 PCR 、原位杂交、 RACE , Northern Blotting , Western Blotting ，蛋白表达，流式细胞分析，拟南芥油菜转基因等实验。欢迎客户来电来信咨询。

I RNA病毒测序
　　RNA病毒测序的技术流程通常包括：病毒的培养和分离、RNA的提取、反转录、PCR扩增、PCR产物纯化和测序、5’和3’RACE等。由于许多致命的病毒都是RNA病毒，例如著名HIV和SARS病毒，因此通常需要较高的实验条件来进行这一工作。我们具备的生物安全三级（P3）实验室和上述完备的实验技术和经验，可以应对您的各种情况。

II TA克隆、测序
TA克隆是一种将PCR产物直接连接到载体的方法。以Taq DNA多聚酶或Tth DNA多聚酶为基础扩增的PCR产物大多在其3’端添加了dA，此时， 如果使用在3’端添加dT的T载体，便会与PCR产物的dA形成互补，方便进行PCR产物的克隆。TA克隆法无需使用特别的引物，也无需进行酶切等特别处理，所以作为PCR产物的直接克隆方法非常普及。
 
TA克隆测序是每个分子实验室几乎每天都要进行的实验操作，步骤繁琐，耗时耗力。本公司长期提供TA克隆测序服务，您只需要提供PCR成功后的反应液，剩下的事情由我们解决，五个工作日后您即可获得测序结果。
客户提供样品（组织、细胞、细菌等）我们可以代提基因组、代设计引物，进行PCR、克隆、测序等服务，大片段我们拼接好提供给客户，价格按照克隆的个数计算。
客户提供PCR产物，我们进行克隆，含测序350元/样品，量大请详询。

III SNP发现及基因分型
SNP(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)，SNP研究包括SNP发现（discovery）、SNP验证（validation）以及SNP筛选（Screening or Scoring）
研究意义：
1、 寻找疾病相关基因的突变位点。
2、 在基因组中分布广泛，突变率低，将逐渐取代微卫星而成为新一代的分子生物学标记。
3、 通过对药物靶点个体差异性分析，调整个体用药的种类及剂量。
4、 对人群进化史研究提供信息。
凭借高通量的试验设备和HAPMAP项目积累的经验，我们可以通过测序方法帮您完成从SNP发现、大规模验证、分型等全套过程。我们期待与您合作。
一、服务基本信息：
1) SNP发现（测序法）：120元/点（超过24个样品DNA）；
2) SNP验证（质谱法）：20元/点（超过96个样品*点）；
3) 交货日期：21个工作日（从发现到大规模验证）；
4) 提交结果方式：发现报告一份、测序结果文件一份、验证报告一份。
二、服务承诺：
1) 14个工作日内通知客户试验结果；
2) 可用同样的方法和过程验证更大数量的样品。
三、您需要提供的协助：
1) 总DNA浓度大于103拷贝/μl，保证在103-105拷贝/μl，提供足够使用的DNA；
2) 提供有关样品来源及DNA提取详细信息；
3) 如需我方提取DNA需另行收费；
4) 一次送样品数（一对引物）需大于96个，如果小于96个按照96个样品进行收费；
5) 样品如需特殊处理，请致电垂询。
四、成功案例：
 乳腺癌易感基因SNP研究
 高胆固醇脂血症相关基因研究
 中国人群乙型肝炎易感基因研究
 中国人遗传性肾脏病（Alport综合征）基因研究
 自身免疫性疾病的相关基因研究
 猪线粒体DNA多态研究
 骨质疏松症基因多态性分析。

IV定点突变
定点突变是指通过聚合酶链式反应( PCR)等方法向目的DNA片段中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的改变DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是研究蛋白质结构与功能关系中一种非常有用的手段。纽斯特生物的定点突变服务能够为你对连接在任意载体
上的DNA片段进行碱基的插入、删除和改变。
1快速：1周左右的时间即能得到正确的片段；
2高质量序列经DNA测序验证，；
3长片段能够突变长达l0kb的片段（包括载体）。 

 服务流程：
1对待突变基因测序结果进行分析l设计突变方案；    ：
2根据突变方案设计合成覆盖突变位点的双向引物，台成目的DNA两端引物，进行高
保真PCR反应：
3 DNA测序验证突变序列的正确性。

客户提供：
1台有待突变基因的高纯度质粒，不少于10 u g，电泳国清晰，达酶切及测序要求；
2待突变基因原始序列文件及原始测序国片文件（不能提供序列的加测序验证费用35元，反应．30元／测序引物）
突变目标序列及详细信息、基因两端酶切位点，井提供待变基因的生物特性，如是否影响细菌增殖等特性；
3相关载体大小、抗性及图谱等信息：默认情况下，突变基因将克隆至T载，若需要克隆至目的载体，请提供目的
体及其详细信息。
我们提供：
1突变成功的重组质粒和甘油菌：
2详细实验报告，包括突变基因测序报告、比对结果
收费标准：询价（相邻的两个碱基突变（6bp以内）按照个点收费。具有复杂结构（如重复结构、回文结构
GC含量过高等）的突变基因将视具体情况而收费。 
V单链构象多态性单链构象多态（SSCP）
SSCP检测是一种基于DNA构象差别来检测点突变的方法。相同长度的单链DNA，如果碱基序列不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。
单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在PAM凝胶中受排阻大小不同.因此，通过PAGE可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。 该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。
技术路线：
1、基因组抽提与质检；
2、PCR扩增靶DNA；
3、将特异的PCR扩增产物变性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子 ；
4、PAGE电泳；
5、银染显色；
6、结果分析与报告。
样品要求：
1、组织样本：-20℃或-80℃低温冰箱中保存，液氮或者干冰运输。若提供的材料为新鲜组织、血液细胞等生物材料，请提供足够提取2ug以上基因DNA的材料量；
2、DNA样本：体积≥20ul，浓度≥100ng/ul，DNA总量≥2ug，20℃保存，低温冰袋运输；
3、血液样本：要求保存于抗凝管中或冻存管中，体积大于2ml，请用干冰运送，保证DNA不降解；
4、样品为石蜡包埋组织切片的，要求提供10张组织切片光片（面积>10mm×10mm,厚度约5-10um）；
服务说明：
1、核酸片段的大小:用于SSCP分析的核酸片段越小，检测的敏感性越高。对于<200 bp的片段，SSCP可发现其中70％的变异；对于300 bp左右的片段则只能发现其中50％的变异；而＞500 bp的片段，则仅能检出10％~30％的变异，因此，<300bp，尤其是150 bp左右的核酸片段更适于SSCP分析。对于大于400bp的PCR产物就需要设法进一步处理，可以用限制性酶消化PCR产物，产生小于400 bp的DNA片段，再进行SSCP分析；
2、游离引物: 游离引物可能同PCR产物结合而改变其泳动率，即使游离引物量为6 nM都有明显影响。因此，应尽可能除去游离引物。可以采用不对称引物扩增方法，尽可能消耗多余的引物。也可以运用过柱或磁性球方法纯化PCR产物。或者是稀释PCR产物，减少游离引物的干扰；
3、假阴性: 一般认为，如没有污染，PCR－SSCP分析不存在假阳性结果，但可能出现假阴性结果，后者是由于点突变引起的空间构象变化甚微，迁移率相差无几所致，尤其是点突变发生在扩增片段的两端时。如果有阳性和阴性对照，结果可以重复确定的突变带是可信的，如果没有阳性对照，应经测序来确定其是否为突变带。由于PCR－SSCP的不足之处主要是可能检出假阴性结果。应通过设置阳性对照，摸索电泳条件，假阴性结果在很大程度上是可以避免的。但对未知基因变异的检测，假阴性结果则难以完全消除。
提交的产品和资料：
1、合成的引物；
2、电泳图谱；
3、实验报告。
VI CDNA差异分析
载体构建
载体构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。本公司拥有一支经验丰富、优秀刻苦的分子生物学实验技术队伍。可根据您的实验要求为您完整各种载体的构建及改造。
实验步骤
(1)目的DNA片段和载体的制备；
(2)目的DNA片段和载体的连接；
(3)连接产物的转化；
(4)克隆筛选。
服务内容
1.以PCR为基础的各类载体构建，如细菌表达载体、酵母表达载体、杆状病毒表达载体、哺乳动物表达载体；报道基因载体等；
2.基因突变，包括单点突变，多点突变，基因缺失等；
3.载体改造；
4.siRNA载体和miRNA表达载体构建。
服务说明
1.客户提供载体构建及改造所需的实验方案，目的基因产物及序列（如果目的基因不好制备），载体（如果本公司载体库里没有）及相关背景资料。
2.若客户只提供组织、细胞等样本，还需提供目的基因NCBI登录号，本公司将额外收取RNA提取及逆转录费用。
3.对于表达载体、报道基因载体以及病毒载体等的构建，您需要提供序列资料、希望克隆到的载体、酶切位点等资料；
4.对于本公司已有的载体和模版，免费提供。
实验报告内容
1.含目的片段的质粒、含该质粒的细菌各一份；
2.引物序列、载体图谱一份、测序结果各一份；
3.载体构建实验所需试剂耗材、仪器设备、操作过程一份.