文献支持冻存人PBMC

提供分离服务:PBMC/人外周血单个核细胞/PBMC细胞/人外周血单个核细胞/冻存PBMC/hPBMC单个核细胞13611631389上海雅裕生物&上海睿安生物

 

新鲜和冷冻保存的人外周血单个核细胞(Human Peripheral Blood Mononuclear Cells)是外周血中具有单个核的细胞的混合群体，是免疫细胞的丰富来源，可以进一步纯化分离单个细胞类型，如天然杀伤细胞(Natural Killer Cell，NK)，T淋巴细胞，B淋巴细胞等。此外，其中的单核细胞(monocyte)与各种细胞因子一起培养，可定向分化为巨噬细胞或树突状细胞等，可增殖不可传代(只增殖一次，不能无限增殖)。

冻存PBMC常规可提供包装:10 Million/支、25 Million/支、50 Million/支、100 Million/支，等等

雅裕生物(睿安生物)细胞分离服务优势(一):信息完备、不断扩种的样本库。
●>350个Donor，正不断扩充
●各批次流式分析报告
●Donor可Recall
●HLA分型:HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-DRB1，HLA-DQB1
●各批次方法应用记录
●Donor经过健康征询和体检筛查，遵循FDA和ISO15189

雅裕生物(睿安生物)细胞分离服务优势(二):合规的招募与采集
●细胞采集通过伦理审查
●密订知情同意和健康问卷
●使用合规的采集机器和耗材采集，耗材和机器可追溯
●全面的体检:全面的体检、血型、血常规22项、传染病-HIV、乙肝五项、丙肝抗体、梅毒(RPR)、EBV、HTLV、B19、CMV(IgG、IgM)
●执行严格的招募标准:(年龄:20-60周岁)(体重:不低于65kg)；无重大疾病史、无慢性病，3个月内无采集记录，传染病检测指标不得有阳性


●制定严格的采集、质控和临床管理SOP
雅裕生物(睿安生物)细胞分离服务优势(三):严格的样本分离和质控
●标准的样本分离解决方案
●严格的质控和与数据记录
●样本运输、冻存等稳定性验证
●标准的制备和冻存SOP
●严格、详尽的质控


测试指标                测试方法                                      标准
①无菌性            细菌、酵母菌:直接培养法；支原体:PCR法                       阴性
②活性             AO/PI染色，用专业细胞活性检测仪器检测                       >90%
③细胞数            AO/PI染色，用专业细胞数量检测仪器检测                       不低于产品规格
④亚型含量检测        Market CD3、CD4、CD8、CD14、CD16、CD19、CD45、CD56 tested by FACS     见COA质量报告
⑤功能性            对部分批次进行功能性验证(ADCC、MLR、ETC)
⑥细胞冻存稳定性检测    长期进行                                           符合上述标准

可控、高效的运输
冻存细胞                                       备注
①干冰或液氮运输                                  根据客户需求选择
②上海及周边地区最快可当日发货，其他地区最快次日发货         上海及其可提供当日送货上门、其他地区3个工作日送达
③可提供温控记录                                 可做到全程有温度记录输出

外周血分离PBMC实验服务是上海雅裕生物/上海睿安生物的基础服务项目之一
(合作询洽13611631389微信同号)
由专业且经验丰富的实验技术人员操作完成。PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell)，外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞(T淋巴细胞、B淋巴细胞)，单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。其中淋巴细胞占很大一部分。分离PBMC的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。

产品优势:

1、稳定高质量的健康人群细胞来源，全部细胞经HBV、HCV、HIV和TP血清学和核酸检测阴性；

2、给予全方位的技术支持(从冷冻细胞复苏到常规实验的-些建议；

3、可提供伦理证明和COA(细胞数量、存活率、B细胞和T细胞比值信息)；

4、可提供新鲜细胞，货期一周；冷冻PBMC细胞:库存充足；

5、保证新鲜细胞活性>90%,，冷冻产品复苏后活性>90%。

 

定制化服务:

1.可根据客户实际实验需要提供小规格产品(1 million)进行测试，测试期间可预留相同Donor其它规格产品；

2.可根据客户实验需求提供某一亚型细胞含量高的产品(如CD56+, CD4+, CD8+, CD3+, CD14+等)；

3.可根据客户实际实验需求筛选制定指标的Donor。

 

 

PBMC人外周血单核细胞培养前的准备:

 

在您带上手套开始细胞培养之前，先检查一下移液管和瓶子的数量是否充足，以免在开始实验后再次出入操作台，这样可以降低细胞污染的风险。细胞培养基也应先预热，选择只预热部分培养基而非整瓶加热，不但可以节约实验时间，而且可以避免因反复加热培养基而造成的蛋白质降解。结束操作后别忘了培养基对光敏感，应尽可能避光保存。

 

细胞培养的定期检查:

定期检查培养细胞的形态，即形状和外观，对于细胞培养实验取得成功至关重要。除确认细胞的健康状态外，每次操作细胞时通过肉眼和显微镜检查细胞还可早期发现污染征象，避免污染扩散至实验室其他细胞。

 

培养瓶/皿等物品的无菌操作:

无菌培养瓶、试剂瓶、培养皿等物品使用时方可揭开盖子，不得将其开放暴露于环境中，操作完成后尽快盖上盖子，取下盖子时应将盖子开口朝下放在工作台面上。

 

PBMC人外周血单核细胞培养中可能的污染物:

细胞培养污染物主要分为两类:化学污染物，如培养基、血清和水中的杂质、内毒素、增塑剂和去污剂。生物污染物，如细菌、霉菌、酵母、病毒、支原体以及其他细胞系的交叉污染。可通过充分了解污染源以及采用良好的无菌技术，降低污染发生的频率和严重程度。

 

细胞换液注意事项:

为细胞换液时，要沿着培养瓶的一侧轻轻地加入，而不是直接加到细胞中，以免损伤细胞，当培养的细胞株较为脆弱时尤其需要注意。使用无菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液体时，每支吸管只能使用一次，以免交叉污染。

 

细胞培养中使用抗生素的注意事项:

细胞培养时不应长期使用抗生素，因为连续使用抗生素会促进抗生素耐药性细胞株的产生，导致轻度污染持续存在。抗生素只能作为对付污染的最后手段短期使用，并尽快撤除。如果长期使用抗生素，则应同时进行无抗生素培养，以便作为鉴别隐性感染的对照。

 

PBMC人外周血单核细胞培养方法:

一、您收到细胞后，请按照以下方法进行操作:取出25cm²培养瓶，75%酒精擦拭培养瓶，拆下封口膜，放入37℃，5% CO₂细胞培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态，然后换用新鲜完全培养液继续培养或进行传代。

二、细胞冻存:

(1)细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm²培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

(2)添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm高心5min；

(3)用适量的冻存液(FBS:DMS0=9:1)重悬细胞，并放置于冻存管中；

(4)先将细胞冻存管放置于-20℃ 1.5h，然后将其移入-80℃过夜，24h后转入液氮中进行长期保存。使用程序降温盒可直接放入-80℃。

三、细胞复苏:

(1)从液氮中取出细胞冻存管(注意:佩戴防爆管面具)，快速将其置入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁；

(2)将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；

(3)弃上清，沉淀用5ml完全培养基重悬，接种25cm²培养瓶，于37℃、5% CO₂细胞培养箱中培养；

(4)第二天，换用新鲜完全培养基继续培养。

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