Trap染色

服务名称 ：Trap染色

提供商 ：XSL

抗酒石酸酸性磷酸酶染色,又称Trap染色，是用于检测骨、骨细胞中破骨细胞的染色，使破骨细胞呈红色，细胞核浅蓝色， 用以显示破骨细胞的分布及数量变化。
Trap染色是用于检测骨组织、骨细胞中特征物质的染色，使破骨细胞呈红色，背景呈绿色或蓝色。抗酒石酸酸性磷酸酶 （Trap）为破骨细胞的标志酶，特异地分布于破骨细胞中，为破骨细胞所特有，通常作为鉴别破骨细胞的重要标志物。在含 酒石酸的酸性条件下，trap能将萘酚AS-BI磷酸盐水解，产生的萘酚AS-BI立即与fast red或六偶氮副品红结合，在酶活性部 位形成不溶性的红色染料，通过观察红色染料的形成可间接了解酸性磷酸酶的活性，进一步鉴别及分析破骨细胞的状态。
骨组织切片及trap染色实验步骤

1. 骨组织脱钙：新鲜骨组织固定于4%多聚jia醛24h以上。将组织从固定液取出置于EDTA脱钙液内脱钙（不能用含酸的脱 钙液脱钙），每3天换一次脱钙液，至骨组织针扎可以顺利通过为止。
2. 取材：在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。
3. 脱水：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75%酒精4h-85%酒精2h-90%酒精2h-95%酒精1h-无水 乙醇I 30min-无水乙醇II 30min-醇苯5-10min-二甲苯I 5-10min-二甲苯II 5-10min-蜡I 1h-蜡II 1h-蜡III 1h。 4、 包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋 面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20°冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
4. 切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。 切片漂浮于摊片机40℃ 温水上将组织展平，用载玻片将组 织捞起，并放进60℃ 烘箱内烤片。待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。

 5、 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精  5min-蒸馏水洗。
 6、 染液配制：A液：0.1mol/L醋酸缓冲液PH5.0：醋酸Na1.3608g+蒸馏水100ml溶解，用Bing醋酸调PH值到5.0。B液：六 偶氮副品红 4%亚肖酸Na：2g亚肖酸Na+去离子水50ml 副品红溶液：副品红2.5g+去离子水50ml+浓盐酸7.5ml，加热至90°溶解后过滤，4°棕色瓶保存。临用前4%亚肖酸Na与副品 红溶液等比例混合。 C液：萘酚AS-BI磷酸酯20mg+N,N-2甲基甲酰胺1ml溶解。 孵育液配制：A液18ml+B液1ml+C液1ml混匀，用1M NaOH或1M盐酸调pH至5.0，再加酒石酸钾Na0.282g，充分溶解过滤 后备用即为TRAP孵育液。
7、 染色：切片置于TRAP孵育液内37°孵育50min，镜下观察破骨细胞呈酒红色为止。蒸馏水漂洗。
8.苏木素染细胞：切片入Harris苏木染3-8min,自然水洗，1%的盐酸酒精分化数秒，自然水冲洗，0.6%氨.水返蓝，流水冲洗。
9.脱水封片：将切片依次放入95%酒精l 5min-95%无水乙醇II5min-二甲苯I5min-二甲苯II5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
10.显微镜镜检，图像采集分析。染色结果：破骨细胞胞浆呈酒红色，核蓝色。
注意事项

1. 试剂配制的过程中，各个试剂的PH值一定要准确，PH不准会导致酶不能被有效激活，导致染色结果不佳。
2. 亚硝酸Na溶液不稳定，容易被氧化，在使用时避免带入杂质，并且为了确保染色结果，最好一到两个星期更换一次。
3. 染trap的骨组织最好用EDTA脱钙，用酸脱钙的组织切片trap为阴性。