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文献和实验
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服务名称 :SNP突变频率检测服务
提供商 :上海威奥
用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白。防止非特异性的RNA的结合。免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来。结合的RNA序列通过microarray(RIP-Chip),定量RT-PCR或高通量测序(RIP-Seq)方法来鉴定。
RIP 技术(RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay,RNA 结合蛋白免疫沉淀)主要是运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA 进行q-PCR验证或者测序分析。RIP 是研究细胞内RNA 与蛋白结合情况的技术,是了解转录后调控网络动态过程的有力工具。RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用,但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物,RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同,如:RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶,抗体需经RIP实验验证等等。
RIP实验步骤
一、获取细胞裂解液
- 冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次
- 加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来,收集至eppendoff管
- 1500rpm,4℃离心5min,弃上清,收集细胞
- 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞,吹打均匀后于冰上静置5min
- 每管分装200μl细胞裂解液,贮存于-80℃
二、制备磁珠-抗体
- 重悬磁珠
- 标记实验所需的eppendoff管
- 吸取50μl 重悬后的磁珠悬液于每个eppendoff管
- 每管加入500μl RIP Wash Buffer,涡旋震荡
- 将eppendoff管置于磁力架上,去上清,重复一次
- 用100μl的RIP Wash Buffer重悬磁珠
- 室温孵育30min
- 将eppendoff管置于磁力架上,弃上清
- 加入500μl RIP Wash Buffer,涡旋震荡后弃上清,重复一次
- 加入500μl RIP Wash Buffer,涡旋震荡后置于冰上
三、RNA结合蛋白免疫沉淀
- 准备RIP Immunoprecipitation Buffer
- 将前上步的eppendoff管放磁力架上,去上清,每管加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer
- 迅速解冻第一步制备的细胞裂解液,离心。吸取100μl上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中,使得总体积为1ml
- 4℃孵育3h至过夜
- 短暂离心,将eppendoff管放在磁力架上,弃上清
- 加入500μl RIP Wash Buffer,涡旋震荡后将eppendoff管放在磁力架上,弃上清,重复清洗6次
四、RNA纯化
- 准备Proteinase K Buffer。每个样品需150ul
- 用150ul Proteinase K Buffer重悬上述磁珠-抗体复合物
- 55℃孵育30min
- 孵育完之后,将enpendoff管置于磁力架上,将上清液吸入一新的enpendoff管中
- 于每管上清液中加入250μl RIP Wash Buffer
- 于每管加入400μl苯酚:氯仿:异戊纯,涡旋震荡,室温下14,000rpm离心10min
- 小心吸取350μl上层水相,吸入另一新的enpendoff管
- 于每管加入400μl氯仿,涡旋震荡15s,室温下14,000rpm离心10min
- 小心的吸取300μl上层水相,吸入另一新的enpendoff管
- 每管加入50μl Salt SolutionⅠ,15μl Salt SolutionⅡ,5μl Precipitate Enhancer ,850μl 无水乙醇(无RNase),混合,-80℃保持1h至过夜
- 14,000rpm,4℃离心30min,小心去上清
- 用80%乙醇冲洗一次,14,000rpm,4℃离心15min,小心去上清,空气中晾干.
- 10-20μl DEPC水溶解,-80℃保存
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