文献支持NADH氧化酶（NOX）测试盒（可见分光光度法）

NADH氧化酶（NADH oxidase，NOX）试剂盒说明书
                                                                 分光光度法 50管/48样

注    意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义： 
NOX（EC 1.6.99.3）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可在氧气存在下，直接将NADH氧化为NAD。该酶不仅参与NAD的再生，而且与免疫反应密切相关。

测定原理：
NOX能够将NADH氧化为NAD，NADH的氧化与2,6二氯酚靛蓝（DCPIP）的还原相偶联，蓝色的DCPIP被还原为无色的DCPIP，在600nm下测定蓝色DCPIP的还原速率计算出NADH氧化酶活性的大小。

需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水

试剂的组成和配制：
试剂一：液体50mL×1瓶，-20℃保存。
试剂二：液体10mL×1瓶，-20℃保存。
试剂三：液体1mL×1瓶，-20℃保存。
试剂四：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂五：液体6 mL×1瓶，4℃保存。
试剂六：粉剂×2瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

• 准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
• 将匀浆600g，4℃离心5min。
• 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
• 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的NOX（此步可选做）。
• 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于NOX活性测定。

血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1. 分光光度计预热30min以上，调节波长至600nm，蒸馏水调零。
2. 样本测定

（1）试剂四、试剂五和试剂六于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min。
（2）在1mL石英比色皿中加入40μL样本、700μL试剂四、100μL试剂五和160μL试剂六，混匀，记录600nm处20s时吸光值A1和 1min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。



NOX活力单位的计算
1、血清（浆）NOX活力的计算:
单位的定义：每mL血清（浆）在每mL反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。
NOX（U/mL）＝ΔA×V反总÷V样÷0.01÷T=2500×ΔA
2、组织、细菌或细胞中NOX活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。
NOX（U/mg prot）=ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织在每mL反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。
NOX（U/g 鲜重）=ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.01÷T=505×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。
NOX（U/10⁴ cell）=ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.01÷T=1.01×ΔA
V反总：反应体系总体积，1mL； V样：加入样本体积，0.04mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量；500：细胞或细菌总数，500万。