文献支持乳酸脱氢酶（LDH）测试盒（微量法）

乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）试剂盒说明书
微量法100管/48样

注    意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
LDH（EC 1.1.1.27）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是糖酵解途径的末端酶，催化丙-酮酸与乳酸之间的可逆反应，伴随着NAD⁺/NADH之间互变。

测定原理：
LDH催化NAD⁺氧化乳酸生成丙-酮酸，丙-酮酸进一步与2, 4 - 二硝-基肼作用生成丙-酮酸二硝-基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，颜色深浅与丙-酮酸浓度成正比。

需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：
提取液：60mL×1瓶， 4℃保存；
试剂一：液体5 mL×1瓶， 4℃保存； 
试剂二：粉剂×1支，-20℃保存，用时加入10μL试剂五和1.3 mL蒸馏水充分溶解备用，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂三：液体5 mL×1瓶，4℃保存； 
试剂四：液体20 mL×1瓶，4℃保存； 
试剂五：液体100μL×1支，4℃保存；

样品测定的准备：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为1000~5000：1的比例（建议2000万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至450nm，蒸馏水调零。

2、样本测定（在EP管中加入下列试剂）

试剂名称(μL)	测定管	对照管
样本	10	10
试剂一	50	50
试剂二	10
蒸馏水		10

充分混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确水浴15min

试剂三

50

50

充分混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确水浴15min

试剂四

150

150

充分混匀，室温静置15min， 450 nm下测定吸光度，计算ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管需要设一个对照管。

LDH活力单位的计算：

1. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、标准条件下测定的回归曲线， y = 0.9108x+0.0037   (x为标准品浓度，umol/mL；y为ΔA)。
2、血清（浆）LDH活力的计算
单位的定义：每mL血清（浆）每分钟催化产生1nmol丙-酮酸定义为一个酶活力单位。
LDH（nmol/min/mL）=（ΔA-0.0037）÷0.9108÷T×10³=73.2×ΔA
3、细胞、细菌和组织中LDH活力的计算
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol丙-酮酸定义为一个酶活力单位。
LDH（nmol/min/mg prot）=[（ΔA-0.0037）÷0.9108×V1]÷(V1×Cpr)÷T×10³ =73.2×ΔA÷Cpr
需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。
（2） 按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol丙-酮酸定义为一个酶活力单位。
LDH（nmol/min/g鲜重）=[（ΔA-0.0037）÷0.9108×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×10³ =73.2×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol丙-酮酸定义为一个酶活力单位。
LDH（nmol/min/10⁴ cell）= [（ΔA-0.0037）÷0.9108×V1]÷(2000×V1÷V2)÷T×10³ =0.037×ΔA
V1：加入反应体系中样本体积，0.01mL；V2：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，15 min；Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；2000：细胞或细菌总数，2000万；10³：1umol/mL=10³ nmol/mL。

b. 使用96孔板测定的计算公式如下：
1、标准条件下测定的回归曲线， y = 0.4554x+0.0037   (x为标准品浓度，umol/mL；y为ΔA)。
2、血清（浆）LDH活力的计算
单位的定义：每mL血清（浆）每分钟催化产生1nmol丙-酮酸定义为一个酶活力单位。
LDH（nmol/min/mL）=（ΔA-0.0037）÷0.4554÷T×10³=146.4×（ΔA-0.0037）
3、细胞、细菌和组织中LDH活力的计算
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol丙-酮酸定义为一个酶活力单位。
LDH（nmol/min/mg prot）=[（ΔA-0.0037）÷0.4554×V1]÷(V1×Cpr)÷T×10³ =146.4×（ΔA-0.0037）÷Cpr
需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。
（2） 按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol丙-酮酸定义为一个酶活力单位。
LDH（nmol/min/g鲜重）=[（ΔA-0.0037）÷0.4554×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×10³ =146.4×（ΔA-0.0037）÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol丙-酮酸定义为一个酶活力单位。
LDH（nmol/min/10⁴ cell）= [（ΔA-0.0037）÷0.4554×V1]÷(2000×V1÷V2)÷T×10³ =0.073×（ΔA-0.0037）
V1：加入反应体系中样本体积，0.01mL；V2：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，15 min；Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；2000：细胞或细菌总数，2000万；10³：1umol/mL=10³ nmol/mL。

1. 标准曲线线性范围为：0.1 umol/mL -2 umol/mL。
2. ΔA线性范围为：0.01 -1。