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文献和实验
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提供商 :暇步康生物
服务名称 :IHC
规格 :张
免疫组化是利用抗体和抗原之间高度特异性结合的原理,先用抗体将组织或细胞中的目的蛋白作为抗原特异性结合,再借助化学的方法将抗体结合的部位显示出来,以达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性,定位或定量的研究。2⃣️抗原修复
将组织切片置于装满柠檬酸抗原修复缓冲液的修复盒中,置于微波炉中进行抗原修复,中火8 min至沸,静置8 min后保温,再转中低火7 min。自然冷却后将玻片置于PBS缓冲液中,在摇床上晃动洗涤3次,每次5 min。
3⃣️阻断内源性过氧化物酶
将切片置于3%双氧/水溶液中,室温避光孵育25 min,将玻片置于PBS中,在摇床上晃动洗涤3次,每次5 min。
4⃣️血清封闭
用组化笔在切片周围画一个组化圈,在组化圈内滴加3%BSA 均匀覆盖组织,室温封闭30 min。
5⃣️加一抗
轻轻甩掉封闭液,在切片上滴加按一定稀释比例配好的一抗,切片平放于湿盒内4 °C孵育过夜。
6⃣️加二抗
将玻片置于PBS中,在摇床上晃动洗涤3次,每次5 min。切片稍甩干后在组化圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织,室温孵育50 min。
7⃣️DAB显色
将玻片置于PBS中,在摇床上晃动洗涤3次,每次5 min。切片稍甩干后在组化圈内滴加新鲜配制的DAB显色液,显微镜下控制显色时间,阳性为棕黄色,当出现棕黄色时即使用自来水冲洗切片,以终止显色。
8⃣️复染细胞核
苏木素复染3 min左右,自来水洗,苏木素分化液分化数秒,自来水冲洗,苏木素返蓝液返蓝,流水冲洗。
9⃣️脱水封片
将切片依次按照75%乙醇5 min→85%乙醇5 min →无水乙醇Ⅰ 5 min →无水乙醇Ⅱ 5 min→正丁醇5 min→二甲苯Ⅰ 5 min 进行脱水透明,将切片从二甲苯拿出来稍晾干,即可用中性树胶封片。
染色观察
使用全自动玻片扫描仪对玻片进行扫描,将图片导出后使用Image J软件统计阳性区域,免疫组化图片使用光学显微镜进行观察拍照。
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