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库存 :100
英文名 :Haemophilus influenzae B
CAS号 :/
保质期 :1年
供应商 :上海晅科生物科技有限公司
保存条件 :-20℃
规格 :50次
流感嗜血杆菌B型探针法荧光定量PCR试剂盒英文名称:Haemophilus influenzae B
B 型流行性感冒嗜血杆菌”简称“HIB”,即 B 型流感嗜血细菌,是儿童鼻 咽部常见的共生细菌,是主要通过脑膜炎和肺炎每年估计造成约 300 万人严重 患病并估计造成 38.6 万人死亡的一种细菌。几乎所有患者都是 5 岁以下儿童, 年龄为 4 至 18 个月的儿童尤为脆弱。因此流感嗜血杆菌 B 型的快速准确鉴定对 该病的预防和治疗有着重要作用。本产品就是以探针法荧光定量 PCR 技术为基 础开发的专门检测流感嗜血杆菌 B 型的试剂盒。
产品特点:
1. 即开即用,用户只需要提供样品 DNA 模板。
2. 根据流感嗜血杆菌B型保守区域设计引物和探针,能专一性地检测出样品中 的流感嗜血杆菌B型。
3. 提供阳性对照,便于区分假阴性样品。
4. 一管式闭管操作,降低了交叉污染。
5. 本只能用于科研,足够 50 次 20μL 体系的荧光定量 PCR。
流感嗜血杆菌B型探针法荧光定量PCR试剂盒包装规格及成分:
编号 |
成分 |
规格 |
试剂一 |
2×Probe qPCR MagicMix | 500 μL(本色盖) |
试剂二 |
荧光 PCR 专用模板稀释液 | 1 mL(黄盖) |
试剂三 |
流感嗜血杆菌B型探针法 qPCR 引物 混合液 | 100 μL(白盖) |
试剂四 |
流感嗜血杆菌B型qPCR 探针 | 50 μL(棕色管) |
试剂五 |
流感嗜血杆菌B型探针法 qPCR 阳性 对照(1×10E8 拷贝/μL) | 50 μL(黄盖) |
试剂六 | 使用手册 | 1 份 |
运输及保存:低温运输,-20℃保存,保存期限为 12 个月。
自备试剂:DNA 模板
使用方法:
一、稀释标准曲线样品(以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)。 由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原, 本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液,最好用带芯枪头, 下同)。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震 荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
7. 如果有 N 个样品,最好设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性 对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为 PC。另外用水作为 NC。
8. 用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼 容。
三、Probe qPCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行)
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个 用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),6 个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用 水做模板),1 个用于 PCR 阳性对照(用第 4 号管的阳性对照稀释液做模 板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后最后加):
成分 | N+2 个 样品管 | PCR 阴性 对照 | PCR 阳性 对照 |
2×Probe qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
流感嗜血杆菌B型 qPCR 探针 | 1 μL | 1 μL | 各1 μL |
流感嗜血杆菌B型探针法 qPCR 引物 混合液 | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
N+2 个待测 DNA 模板 | 7 μL | ||
超纯水 | 7 μL | ||
第 7 步所得标准曲线样品稀释液 (2-7 号) | 各7 μL(2 号样到 2 号管,3 号样到 3 号管…) |
11. 盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR:
过程 | 温度 | 时间 |
预变性 | 95℃ | 5 min |
PCR 反应 (40 个循环) | 95℃ | 15sec |
60℃ | 1 min(采集 FAM 通道的荧 光信号) |
四、数据处理
12. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值 为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值,再推算出其浓度。
13. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小 于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。若重复结果 Ct 值小于 40,扩增曲线有明显起峰,该样本判断为阳性,否则为阴性。
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