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文献和实验
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保质期 :1年
供应商 :山东绿都
保存条件 :-20
非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂盒(免提法)试剂盒应用
本试剂盒主要用于动物组织及血液中非洲猪瘟病毒DNA的扩增。将组织液(包括组织研磨液、细胞悬液、血液、血清、精液、唾液、尿液等)、组织块以及环境和拭子等样本进行处理后,可直接用于扩增。本试剂盒中使用的Rapid DNA-Lysis采用独特配方,能够快速高效的裂解各种常见样本,无需反复离心,从而获得高质量的DNA。试剂中引入了dUTP/UDG防污染系统,可消除扩增污染对qPCR的影响。
本试剂盒仅供研究使用,不可用于食品、化妆品等领域。
试剂盒组成
组分 | (50次) |
Rapid DNA-Lysis | 1 mL |
荧光PCR反应液 | 1 mL |
样品稀释液 | 1.5mL×4 |
阳性对照 | 50 μL |
阴性对照 | 50 μL |
说明书 | 1份 |
-20ºC保存。
使用前将Rapid DNA-Lysis室温充分混匀;荧光PCR反应液、阳性对照溶解后需置于冰上。
需要准备
荧光定量PCR仪、恒温金属浴、离心机、移液器
使用方法
一、不同样品的处理方法
- 组织液的处理
(2)加入20 μLRapid DNA-Lysis。
(3)混匀。
(4)置于55℃作用5分钟,加入100μL样品稀释液,混匀后,取上清。
- 组织块的处理
(2)加入20 μL Rapid DNA-Lysis。
(3)混匀。
(4)置于55℃作用5分钟,加入100μL样品稀释液,混匀。
(5)8000转离心30秒取上清。
- 环境样本和拭子的处理
(2)吸取10 μL(1)中液体,加入20 μLRapid DNA-Lysis。
(3)混匀。
(4)置于55℃作用5分钟。加入100μL样品稀释液,混匀取上清。
4. 提取对照的处理
(1)在上述1,2,3样品处理的同时,取10 μL(生理盐水、PBS或水)加入20 μL Rapid DNA-Lysis。
(2)混匀。
(3)置于55℃作用5分钟,加入100μL样品稀释液,混匀取上清。
二、在DNase free 的离心管中配制荧光定量PCR反应体系
阴性对照(20 μL) | 待检样品(20 μL) | 阳性对照(20 μL) | 提取对照(20μL) | |
荧光 PCR反应液 | 18 μL | 18 μL | 18 μL | 18 μL |
待检样品 | - | 2 μL | - | - |
阳性对照 | - | - | 2 μL | - |
阴性对照 | 2 μL | - | - | - |
提取对照 | - | - | - | 2 μL |
步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
污染消化 | 37oC | 2min | 1 |
预变性 | 95 oC | 2min | 1 |
变性 | 95 oC | 10 s | 40 |
退火延伸 | 60 oC | 30s |
四、结果判定
阳性对照:Ct值<35且有明显扩增曲线,呈典型的S型曲线。
阴性对照:无Ct值,无明显扩增曲线,结果成立。
待检样品:Ct值>40或无,则为阴性。
35,且有S形扩增曲线,则为可疑。若无明显扩增曲线,则为阴性。可疑样品需重新处理样品后再次检测,若Ct<40且出现S形曲线,则为阳性,反之为阴性。
Ct≤35,且有明显的S形扩增曲线则为阳性。若扩增曲线呈不规则形状需重新检测。
注意事项
- 所有试剂应按照规定温度储存。请勿反复冻融。
- 检测过程应按照分区(试剂准备区、样本制备区、核酸扩增区)进行。各区物品专用,不得交叉使用,避免污染。
- 检测前后均需要对操作区进行消毒,消毒方式可以采用75%乙醇或核酸消除剂等。耗材(包括吸头、PCR管)均需要无酶处理或使用商品化的无酶耗材。
- 为了避免对检测结果的影响,应避免使用含有荧光物质的手套,避免用手直接接触各项试剂,预防交叉污染。
- 采集全血时应当使用枸橼酸钠抗凝,而不要使用肝素、EDTA。
- 样品处理过程中应当防止交叉污染,推荐按照以下加样顺序加样,依次为阴性对照、待检测样本、阳性对照。
- 使用阳性对照时应特别注意防止污染。
- PCR反应完成后,用完的PCR管直接丢弃,严禁在实验室开盖,以防止气溶胶污染。
- 为防止试剂盒污染,请勿将不同批号试剂盒混用。
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