人肾类器官分化试剂盒 培养基

品系 ：无

ATCC Number ：无

细胞类型 ：干细胞

肿瘤类型 ：无

CAS号 ：无

供应商 ：弗元（上海）生物科技有限公司

库存 ：100

注册证号 ：无

英文名 ：Human Vascularized Kidney Organoids Differentiation Kit

生长状态 ：良好

年限 ：1

运输方式 ：冷冻

器官来源 ：多能干细胞

是否是肿瘤细胞 ：多能干细胞，ES，iPSC

细胞形态 ：类器官

免疫类型 ：无

物种来源 ：人

相关疾病 ：无相关疾病

组织来源 ：无

规格 ：KIT

货号	产品名称	目录价（元）
RC200134	人肾类器官分化试剂盒	5625

  产品信息
产品名称：人肾类器官分化试剂盒
货号：RC200134
批号：见包装
试剂清单：

序号	名称	数量	货号	存储
1	S1完全培养基	50 ml ×1	RC200134-1	-20至-80   ℃
2	S2完全培养基	50 ml ×1	RC200134-2	-20至-80 ℃
3	S3完全培养基	50 ml ×1	RC200134-3	-20至-80   ℃
4	S4完全培养基	100 ml ×2	RC200134-4	-20至-80 ℃
5	基础培养基	500 ml ×1	RC200134-5	2-8 ℃

存储与有效期：
组分1、2、3、4于-20至-80 ℃避光保存，必须避免反复冻融；首次完全解冻后可以按使用量进行分装，置于-20至-80 ℃长期保存；2-8 ℃条件下，稳定储存2周。组分5于2-8℃避光保存，有效期1年。
适用范围：
本试剂盒适用于人多能干细胞（胚胎干细胞、诱导多能干细胞）定向肾系细胞分化，同时进行立体培养，形成血管化肾类器官。
产品介绍
类器官与悬浮培养是当前再生医学研究与应用的前沿，是未来再生医学与组织工程发展的趋势。为适应日益发展的科研需求，并为生命科学尤其是再生医学研究的需要，开发优化了相关产品，可以为科研工作者提供稳定的研究平台，以助力研究的时效性和经济性。该产品设计同时考虑再生医学临床前研究的需求，可以为研究人员提供大量稳定的种子细胞，加速应用后期技术的研发。
本产品无血清、成分明确、含有细胞保护因子，适合于人多能干细胞向肾类器官的诱导，血管标志物KDR在该肾类器官部分细胞中表达阳性，说明该肾类器官能获得部分血管化。
操作方法
实验准备

1. 完全培养基准备：

组分1-4（S1、S2、S3、S4）均为完全培养基：2-8℃解冻。完全融化后轻轻摇匀，可以按照实际使用量分装。分装后立即存储于-20至-80 ℃，避免反复冻融。
注意：2-8℃冰箱过夜，切不可置于37℃水浴剧烈解冻，解冻后请务必充分混匀，以保证培养基成分的均匀度。冷冻组分解冻时会有絮状沉淀或结晶，每次使用前混合均匀使用即可，不影响使用效果。

1. 自备试剂耗材：

1. 多能干细胞完全培养基（推荐使用mTesR1培养系统）
2. 多能干细胞消化液（Accutase等）
3. 基质胶
4. 贴壁细胞培养板
5. 低吸附细胞培养板
6. Rock抑制剂（Y27632）
7. 细胞固定液（2-4%中性多聚jia醛）

操作方法

1. S1阶段：人多能干细胞生长至约60%汇合开始血管化的肾类器官诱导分化，要求人多能干细胞克隆形态良好。用基础培养基（RC200134-5）每孔2-3 ml洗细胞2次，加入S1完全培养基每孔2 ml，每天换液，连续4天。该阶段为原条诱导阶段（primitive streak）。有部分细胞死亡为正常现象。

注意：本操作方案以六孔板为例，若使用其他器皿可以根据需要自行调整方案。调整方案时建议以细胞密度为稳定因素。细胞培养箱条件为37℃、5% CO₂、饱和湿度。所有培养基在使用前必须进行室温复温。这些注意事项同样适用于以下步骤。
注意：起始的多能干细胞（ES、iPSC）对后续诱导成功非常关键，请务必保证诱导时多能干细胞生长状态良好，50-60%汇合（参考诱导形态示例图）。该阶段诱导过程中有部分细胞死亡为正常现象。

1. S2阶段：诱导第5天，用基础培养基每孔2-3 ml轻柔洗细胞2次，加入S2完全培养基每孔2 ml，每天换液，连续3天。该阶段为肾中胚层特化阶段（kidney mesodermal specialization）。

注意：移液枪吹打细胞时务必轻柔，切不可产生大量气泡，本试剂盒全程均需注意此问题。

1. S3阶段：诱导第8天，用基础培养基每孔2-3 ml轻柔洗细胞2次，加入S3完全培养基每孔2 ml，每天换液，连续4天。该阶段为肾祖细胞阶段（nephronic progenitor cells）。
2. S4阶段：诱导第12天，用DPBS每孔2-3 ml轻柔洗细胞2次，加入适量（每孔1 ml）消化液Accutase（Gibco，货号A1110501），同时加入终浓度为10 µM的Rock抑制剂（Y27632）以提高细胞存活率。细胞消化约3-6分钟，待细胞易吹下即加入适量（每孔1-2 ml）S4完全培养基终止消化。收集细胞悬液到离心管中，800 转/分离心5分钟，弃上清；用适量S4完全培养基重悬细胞，同时加入终浓度为10 µM的Rock抑制剂（Y27632）。细胞接种于低黏附的培养器皿，6孔板一个孔消化的细胞接种于1个低黏附6孔板的一个孔，S4完全培养基加入量为每孔2-3 ml，每天用S4完全培养基每孔2-3 ml换液（不需添加Rock抑制剂）。培养过程中可通过低速离心的方式去除死细胞。若细胞团块过大，可以用枪头轻柔吹打至均一大小，继续培养至第24-26天。该阶段为相对成熟的阶段（maturation of kidney cells）。

注意：低速离心的方法为，收集细胞悬液，置于离心管中，建议200转/分，离心3-5分钟，弃上清。死细胞不会沉底，弃上清即可去除死细胞。细胞沉淀用完全培养基重悬，继续培养。
注意：S4阶段诱导过夜后细胞便会聚团成球（参考诱导形态示例图），若此时成球不明显，则后续成功的可能性很小，请注意根据形态示例图判断。
注意：继续培养过程中，若细胞团数量过多，可适当分到其他孔中继续培养。

1. 推荐检测：第0天、5天、12天及24-26天的各阶段标志物。第0天检测多能干细胞标志物，如OCT4、SOX2等；第5天检测原条阶段的标志物，如T/Brachyury、MIXL1等；第12天检测肾相关标志物，如SIX2、SALL1、NPHS1等，此阶段起可检测血管标志物KDR等；第24天检测相对成熟肾标志物，如JAG1、CDH1、LTL、AQP1、NPHS1、CD31、KDR等。

特别提示：以上所有操作均在无菌细胞培养室进行，细胞开放操作要在生物安全柜内进行；该研究常用的培养器皿包括培养皿、培养板，也可自行设计方案使用细胞培养瓶、细胞工厂等，请根据实验需要自行选择；细胞的初始状态对分化的成功至关重要，请务必保证初始细胞的可靠性。该试剂盒仅用于定型内胚层细胞向肾类器官分化的研究，用于其他研究时该操作规程仅作为参考。
诱导过程示意图：

诱导形态示例图：

弗元生物是国家高新技术企业、上海市科委认定的科技型企业，致力于打造具有国际影响力的生物医学品牌。公司以干细胞与再生医学研究为核心，业务经营范围辐射生物医学领域的多个相关学科。团队拥有自主研发的核心知识产权，在国际期刊杂志发表论文8篇，中文核心期刊发表论文1篇，申请国家发明专利7项，已获得授权的实用新型专利2项，拥有注册商标9项。

    生命科学部，已经形成以无血清培养基、肝类器官分化试剂盒为旗帜产品的充质干细胞、再生医学与器官发育等多个产品系列；肝类器官分化试剂盒为国内开创性肝类器官产品；产品已获得nature communications、cell proliferation、stem cell research and therapy等杂志文献引用。技术服务部，服务了多家知名企业和科研机构，在再生医学的基础和转化研究完善了服务体系。