保存条件 ：常温（15-30℃）

保质期 ：12个月

英文名 ：GoldHi EndoFree Plasmid Maxi Kit

库存 ：大量

供应商 ：康为世纪

规格 ：2 preps/10 preps

无内毒素质粒大提试剂盒产品内容：

产品介绍

内毒素是质粒提取中常见的污染物，由于真核细胞对内毒素非常敏感，因此，如果质粒中含有内毒素会大大降低真核细胞转染效率。本试剂盒提供一种简单快捷高效提取无内毒素质粒的新方法，在碱裂解法裂解细胞的基础上，采用独特的硅基质膜吸附技术，高效专一的结合质粒DNA；同时采用特殊的缓冲液系统和除内毒素过滤器，有效去除内毒素、基因组DNA、RNA、蛋白等杂质。每次可处理100-300 ml菌液，获得多至2 mg转染级质粒DNA，整个提取过程只需50分钟。本试剂盒所得质粒纯度高、提取量大，特别适用于细胞转染，同时也可用于DNA测序，PCR，体外转录，内切酶消化等实验。


操作步骤：
1. 取150 mL过夜培养的菌液，加入离心管（自备）中，12,000×g离心2-3分钟收集细 菌，尽量吸弃全部上清。
2. 向留有菌体沉淀的离心管中加入12 mL Buffer P1（请先检查是否已加入RNase A） 使用移液器或涡旋振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀。 注意：如果菌块未彻底混匀，将会影响裂解效果，使提取量和纯度偏低。对于低拷贝质粒，作用菌液 量较大时需要按比例增加P1、P2、E3的使用量，请参考下方表

3.向离心管中加入12 mL Buffer P2，温和地上下颠倒混匀8-10次，使菌体充分裂解， 室温放置5分钟。此时溶液应变得清亮粘稠。 注意：温和混匀，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。 如果溶液未变得清亮，提示可能菌量过大，裂解不彻底，应减少菌体量。
4. 此时进行柱平衡：向已装入收集管中的吸附柱（Spin Columns DZ）中加入2 mL Buffer PS，12,000 ×g离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：第4步柱平衡完成后（Buffer PS过柱）直至用于第7步（上清与异丙醇混合液过柱）建议有 15-30分钟的时间差，可使提取得率提高。
5. 向离心管中加入12 mL Buffer E3，立即上下颠倒混匀8-10次，此时出现白色絮状沉 淀，室温放置5分钟。12,000×g离心10分钟，将上清转移至干净离心管（自备） 中，注意不要带入沉淀。 注意：Buffer E3 加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。
6. 加入0.3倍上清体积的异丙醇，上下颠倒混匀。 注意：加入异丙醇过多容易导致RNA污染。
7. 将上清与异丙醇的混合溶液转移到步骤4已平衡好的吸附柱DZ（已装入收集管） 中。12,000×g离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 注意：吸附柱的最大容积为15 mL，所以第7步中所得溶液分多次过柱。如果离心机转子倾角较大 时，建议加入吸附柱的溶液体积不超过10 mL，以防发生漏液现象。
8. 向吸附柱中加入10 mL Buffer PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000×g离 心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
9. 重复步骤8。
10. 向吸附柱中加入10 mL Endo-Free Buffer PW，12,000×g离心2分钟，倒掉收集管 中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
11. 将吸附柱重新放回收集管中，12,000×g离心5分钟，倒掉废液，将吸附柱置于室温 数分钟，以彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液。 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR 等）。
12. 将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位加入1-3 mL Endo-Free Buffer EB，室温放置2-5分钟，12,000×g离心5分钟，将质粒溶液收集到离心管 中。-20℃保存质粒。 注意：1）为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2-5分钟， 12,000×g离心5分钟，将质粒溶液收集到离心管中。 2）质粒拷贝数较低或>10 kb时，Endo-Free Buffer EB在65－70℃水浴预热，可以增加提取效率。


注意事项 ：
1、所有组分可在干燥、室温（15-30℃）环境稳定保存1年，将吸附柱置于2-8℃可保 存更长时间，加入RNase A的Buffer P1 置于2-8℃可稳定保存6个月。
2、Buffer P1在使用前先加入RNase A（将试剂盒中提供的RNase A 全部加入），混 匀，置于2–8℃保存。使用前需在室温中放置一段时间，恢复至室温后使用。
3、第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer PW中加入无水乙醇。 使用前请先检查Buffer P2、Buffer E3是否出现结晶或沉淀，如有结晶或沉淀现象， 可在37℃水浴几分钟，即可恢复澄清。
4、注意Buffer P2和Buffer E3含有刺激性物质，请戴手套操作，使用后应立即盖紧盖子。
5、使用Buffer PS处理过的吸附柱放置15-30分钟后再进行混合液过柱，效果较好，不 建议放置超过30分钟使用。
6、提取质粒的量和纯度与细菌培养浓度、菌株种类、质粒大小、质粒拷贝数等因素有关。 质粒提取菌液量应不超过表1和表2中推荐的体积，高拷贝质粒提取的P1、P2和E3 溶液的用量均为12 mL；而对于低拷贝质粒提取，P1、P2和E3溶液的用量应根据 菌液量调整P1、P2和E3溶液的用量，可参考下方表：


无内毒素质粒大提试剂盒  Q&A 

Q1：得率低
A1：菌体中无质粒（需确认质粒未被污染，并确认质粒拷贝数是不是低拷贝质粒，菌液体积小提为1-5 ml，中提为5-15 ml，大提100-300 ml），菌液体积要适当。A2：大肠杆菌老化（一般甘油保存菌株，需活化后重新培养摇菌进行提取）；4°C保存菌液时间过长，建议使用新鲜菌液。A3：溶液使用不当：使用前若发现Buffer P2、Buffer N3、Buffer PB有沉淀，需在37℃水浴几分钟，恢复澄清后使用。A4：操作不当：加入洗脱液时，未垂直悬空加入柱膜中间洗脱质粒；加入洗脱液EB后未静止2分钟直接洗脱。

Q2：纯度低
A1：有RNA污染（需确认RNase A是否加入Buffer P1中，加入RNase A的Buffer P1 置于2-8℃保存6个月有效。）A2：对于含有大量核酸酶的宿主菌，建议用含有去蛋白液的提取试剂盒。（高纯质粒提取试剂盒CW0500）A3：Buffer PW中使用前是否按要求加入无水乙醇。A4：质粒点样飘出孔,PW洗涤后晾干2-5分钟彻底去除无水乙醇的残留。A5：有基因组污染：加入溶液P1、P2后，混匀不要太剧烈，温和地上下颠倒混匀4-6次。