细胞铁死亡检测

提供商 ：君礼生物科技（上海）有限公司

服务名称 ：细胞铁死亡检测

规格 ：样

 

一、铁死亡介绍

铁死亡，是一种调节细胞死亡的方式，主要是铁超载和活性氧（ROS）依赖的脂质过氧化物累积引起的。主要表现为，与正常线粒体相比膜密度更致密，体积更小，嵴减少或消失，外膜破裂。线粒体是铁利用、分解代谢和合成代谢途径的主要细胞器，在铁代谢、物质代谢和能量代谢中起着中心作用。线粒体脂质代谢的关键调节因子(如ASCF2和CS)、铁稳态(如铁蛋白、mitoferrin1/2和NEET蛋白)、谷氨酰胺代谢和其他信号通路的干扰会对铁敏感产生影响。

二、铁死亡的相关特征

三、铁死亡的相关检测

细胞活性检测

1）CCK-8检测

检测方法：CCK-8试剂中含有WST–8，它在电子载体1-Methoxy PMS的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物（Formazan），生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比，可采用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，间接反映活细胞数量，可鉴定铁死亡造成的细胞死亡。

2）LDH法

检测方法：细胞死亡伴随的细胞膜结构破坏会导致细胞质中的内容物释放到培养液中, 其中包括活性较为稳定的LDH, 因此检测LDH的释放可用于死细胞和受损细胞的定量分析。

LDH的相对水平通过其体外酶活力来反映, 即在LDH催化乳酸脱氢的作用下, NAD+被还原生成NADH, 而NADH和四唑盐类化合物被硫辛酰胺脱氢酶催化反应生成NAD+和红色甲臜, 生成的红色甲臜在490 nm下产生吸收峰, 通过比色法可以定量乳酸脱氢酶的活性, 进而测定死细胞和受损细胞的数量。

铁含量的检测

细胞铁积累是铁死亡的典型标志之一，亚铁离子积累可以特异性地增加氧化应激水平。

1）荧光探针法

检测方法：可以使用PGSK探针，流式细胞术或共聚焦显微镜检测细胞内铁含量的细胞膜透性染料检测细胞、组织中的铁水平，在铁死亡的细胞中，PGSK的绿色荧光会减弱。铁的含量能够指示铁死亡是否发生，铁离子含量与铁死亡正相关。

含有氮氧化物结构的荧光探针如 RhoNox-1 能够与 Fe2+ 特异反应, 从而使自身还原成能被激发成强荧光表达的结构。通过对荧光强度进行检测, 可实现在活细胞或者冰冻组织切片上对Fe2+ 进行半定量分析。

FerroOrange 和 Mito-FerroGreen 等探针也可以用于特异性检测不稳定Fe2+ 的含量。

活性氧 (ROS) 检测

检测方法：细胞内活性氧和脂质活性氧通过流式细胞术使用C11-BODIPY 荧光探针检测，BODIPY 581/591 C-11是一种亲脂染料，能积累在细胞膜内，用 488nm和568nm激发，将检测到530nm和590nm发射光（红色荧光），当染料被氧化后，发射光将从590nm迁移到510nm（绿色荧光），荧光由红色转为绿色，荧光强度与铁死亡正相关。

 

铁死亡相关诱导和调控分子表达的检测（WB/qRT-PCR检测）

1）铁死亡相关诱导和调控分子蛋白表达水平的检测

免疫检测法包括 Western blot、免疫荧光和免疫组织化学等, 可通过检测调控铁死亡过程多个通路中的关键分子如SLC7A11（铁死亡时降低，55kDa）、GPX4 （铁死亡时降低，19kDa）、ALOX12（铁死亡时升高，73kDa）、FTH1（铁死亡时降低，22kDa）、TFRC（铁死亡时升高，85kDa）、xCT（铁死亡时降低，35kDa）等。

铁死亡通路中的其他调控蛋白如 TfR1（铁死亡时降低，89kDa） 、ALOX12（铁死亡时升高，73kDa）、 NRF2（铁死亡时降低，75kDa）、 ACSL4 （铁死亡时升高，79kDA）的表达等的表达水平来表示铁死亡的发生。

2）铁死亡相关诱导和调控分子基因表达水平的检测

荧光定量PCR方法可通过检测铁死亡关键分子的基因表达水平来表征铁死亡的发生。除了那些编码铁死亡关键调控蛋白的基因, 编码前列腺素内过氧化物合成酶2的基因PTGS2和谷胱甘肽特异性γ-谷氨酰基环转移酶1的基因CHAC1的表达水平也常常作为铁死亡的生物标记来使用, 并广泛应用在铁死亡相关的体内和体外研究中。

 

透射电镜观察细胞形态

检测方法：检测细胞形态，细胞发生铁死亡时线粒体变小，膜密度增高，嵴减少甚至消失。

▲使用透射电镜观察细胞发生铁死亡的形态

线粒体膜电位检测

检测方法：使用TMRE荧光染料检测，TMRE能够特异性标记有活性的线粒体，是一种细胞膜可穿透性的，正电荷的，橘红色荧光染料，当线粒体膜电位降低时，荧光减弱，通过流式细胞仪收集TMRE阳性细胞的比例。

此外，还可用JC-1荧光探针检测，当线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物，488nm激发时的最大发射波长为590nm，可以产生红色荧光；当线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体基质中，此时JC-1为单体，488nm激发时最大发射波长为527nm，可以产生绿色荧光，荧光强度与铁死亡正相关。

谷胱甘肽检测 检测方法：还原型谷胱甘肽（GSH）与铁死亡负相关，氧化型谷胱甘肽（GSSG）与铁死亡正相关，通过检测GSH或GSSG的水平，就能检测铁死亡。

脂质过氧化

铁死亡相关的脂质过氧化反应过程能够产生大量的脂质过氧化产物, 其中LOOHs作为脂质过氧化反应的初级产物, 会在氧化反应过程中逐渐分解成一系列复杂的醛类化合物, 包括丙二醛 (malondialdehyde, MDA)、4-羟基壬烯醛 (4-hydroxynonenal, 4-HNE)、己醛等, 这些活性醛类物质会攻击蛋白等生物大分子, 形成加合物引起细胞发生进一步损伤。

检测方法：酶联免疫吸附法 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 是一种将抗原抗体免疫反应的特异性和酶高催化作用结合的用于定量分析的免疫测定技术, 能够定量分析铁死亡过程产生的 MDA、4-HNE-蛋白质配合物。蛋白质免疫印迹法 (Western blot) 和免疫染色法利用MDA、4-HNE 特异性的抗体, 也可以用于检测和定量 MDA、4-HNE 蛋白质配合物。 

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