外泌体Biomarker研究一站式解决方案价格

提供商：生物芯片

服务名称：外泌体研究

外泌体：一种由活细胞主动释放的细胞膜内陷形成且特异性包裹了多种RNA和蛋白质的囊泡，直径约为30-150nm。外泌体特异性携带的多种分子是其参与细胞间通讯的物质基础，并且不同细胞类型来源的外泌体还分别参与了机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、肿瘤侵袭等多种功能活动，这引起了研究者对其功能探索的极大兴趣。研究发现几乎所有细胞类型均可分泌外泌体，不同来源外泌体反映了疾病的信息，非常适合作为Biomarker，且外泌体天然存在于多种体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁，这也使得研究者加强了在外泌体中开发诊断和预后相关Biomarker的研究。
上海生物芯片有限公司为您在外泌体Biomarker的研究中提供了一站式解决方案，包括从样本中进行外泌体分离、鉴定颗粒粒径及浓度、针对外泌体优化的基因芯片、二代测序和4D质谱检测进行高通量筛选、机器学习算法帮助Biomarker发现以及数字PCR和Simoa的精确验证。

方案设计

纳米颗粒跟踪分析（NTA）介绍
目前主要的外泌体分离方法是依据外泌体直径、结构等特点进行富集，或对特定膜蛋白进行捕获，产物中不可避免包含一些其他类型的囊泡，需要对外泌体进行鉴定，以保证其浓度和纯度。2014年国际细胞外囊泡学会（ISEV）提出，外泌体鉴定分为三个层面：电镜鉴定形态学特征、NTA鉴定粒径和浓度及蛋白标志物的检测。

Zetaview（ParticleﾠMetrix）可快速、稳定地进行外泌体粒径、浓度和纯度鉴定。其方法原理为纳米颗粒跟踪分析（NanoparticleﾠTrackingﾠAnalysis，NTA）、单一颗粒跟踪技术并结合经典微电泳技术（zeta电位）和布朗运动，利用Stockes-Einsteinﾠ方程式计算出纳米颗粒的流体力学直径和浓度。NTA技术通过搭配相应滤光片测量荧光抗体（如CD9,CD63, CD81等）标记的外泌体来测定外泌体纯度，其优点为简单、快速，且不破坏外泌体原始状态。

实际样品检测结果图

SBC自主研发的外泌体蛋白鉴定Pane（l Digital Western Blot）

外泌体组学高通量筛选
不同类型的细胞在不同生理、病理状态下，所分泌的外泌体中包含的RNA与蛋白质分子不同，这些分子以外泌体为载体进入靶细胞后，会通过不同的机制对靶细胞产生影响。
SBC 根据多年高通量实验服务经验，经过多次实验优化开发了适合外泌体RNA（mRNA、lncRNA、circRNA 及miRNA等）和蛋白质分析的基因芯片、二代测序以及4D 质谱检测服务，全面提升了外泌体研究的广度与深度。SBC 提供的高通量筛选工具如下：

机器学习筛选Biomarker
基于外泌体基因和蛋白质数据集（mRNA, lncRNA, circRNA 和蛋白质可单独或者集合使用），采用机器学习算法的训练和测试，并评估性能，以此来筛选诊断或预后的Biomarker。

外泌体验证利器—微滴式数字PCR（ddPCR）
基于泊松分布原理建立的一种核酸分子绝对定量技术。通过微滴发生器形成上万个微滴，其中每个微滴或不含或含有一个至数个核酸靶标分子。每个单分子进行PCR扩增，探针用于检测特定序列的靶标。随后逐个对每个微滴检测有无荧光信号，最终根据阳性微滴的比例，按照泊松分布的原理，通过软件计算出待检靶分子的拷贝数。

>> 仪器
微滴式数字PCR - BIORAD QX200，可对DNA或RNA分子进行绝对定量分析，适用于EvaGreen或探针的数字PCR。

>> 主要特点
1、便捷的测定设计，不需要标准曲线
2、可通过增加PCR反应的数量提高精确度
3、可高度耐受PCR反应抑制剂
4、可精确鉴定目标拷贝数，分析微小差异
5、简便而易用的工作流程，一次可以检测 96 个样品
6、灵活的数字 PCR 化学方法，已针对 TaqMan 水解探针和 EvaGreen 测定进行优化

外泌体蛋白质验证利器--单分子免疫阵列分析（Simoa）
Simoa技术采用经典的双抗夹心酶联免疫吸附测定法（ELISA）实现极低含量的蛋白定量检测。其关键技术在于将免疫复合物捕获并密封在一个含有超过20万个飞升级别小孔的芯片中反应，以实现单个分子的检测，大幅提升检测灵敏度，因此有被称为数字式ELISA，比传统ELISA方法灵敏度高出1000倍。Simoa技术可对传统方法无法检测到的低浓度生物标志物进行准确分析，为生命科学研究、体外诊断、伴随诊断和血液筛查等领域开创了新的研究前景。

>> 仪器
美国Quanterix公司研发的Simoa HD-X数字式单分子免疫阵列分析仪，可以直接对血清、血浆等体液和外泌体中的蛋白进行超高灵敏度检测。

>> 主要特点
1、灵敏度高：比现有的常规免疫检测方法灵敏度平均高1000倍以上，可检测非常低浓度的蛋白标志物，同时为检测和验证新的生物标志物提供了有力工具。所需样本含量少，节约珍贵样本，减少基质效应。
2、全自动化：SimoaﾠHD-X分析仪自动化完成稀释、混合、洗涤、孵育以及结果的读出/分析，实现从样本到结果一站式检测，不依赖工作人员，保证结果的重复性和精准性。
3、多重检测：统一芯片内可以同时完成多达10种不同目标分子的检测，可在一个样本中同时检测多个指标，减少了样本与实际使用量，节约了成本。
4、高精准度：数字化和自动化技术使实验结果的变异系数（CVs）低于10%，结果科学可靠。
5、线性范围广：针对低浓度和高浓度样本分别采用数字检测和模拟检测两种数据分析方式，检测动态范围＞ 4 个数量级。
6、自主研发：提供多种商品化试剂盒，用户还可以利用SimoaﾠHomebrew试剂盒进行实验方案开发和优化，适合于科研创新和开放性研究。

应用案例（一）

外泌体中长链RNA作为胰腺管腺癌诊断标志物研究
影响因子：31.79 发表时间：2020.03 发表期刊：Gut

胰腺导管癌（PDAC）在能进行手术切除阶段被诊断出来是比较困难的，常用标志物CA19-9的灵敏度只有75.4%，特异性77.6%。这篇发表在Gut上的研究工作，在循环系统的血浆外泌体中鉴定出由8个基因组成的命名为d-signature的诊断标志物组合，能够以更高灵敏度及特异性诊断PDAC，并很容易诊断出stageﾠI/II的PDAC。d-signature还可以区分CA19-9阴性PDAC病例和健康对照组，从而补充CA19-9在PDAC诊断中的应用，为病人争取手术治疗的窗口期。在PDAC与慢性胰腺炎的鉴别也具有较高的准确性，减少不必要的手术。
文章对117例健康对照，284例PDAC和100例慢性胰腺炎病人的血浆分离外泌体，并对外泌体进行鉴定（图1）。进一步对外泌体RNA进行全转录组测序分析（图2），并与TCGAﾠ178个PDAC组织数据和GTEx171正常胰腺组织数据整合，筛选外泌体和组织中共同上调基因398个(FDR<0.05,fold change >1.4)。

对候选的标志物基因，利用机器学习方法LASSO和随机森林训练出8个基因组成的诊断标志物组合d-signature（图3，4）。
该研究表明了外泌体RNA 在更高精准地发现并建立PDAC 诊断标志物中的价值。验证的标志物组合d-signature对可切除的PDAC 诊断有潜在的临床应用价值，可以减少患者错过手术治疗的窗口期，使其从最佳治疗中获益。

应用案例（二）

外泌体蛋白质组研究哮喘患者单核细胞来源的树突状细胞功能
影响因子：14.290 发表时间：2021.4.25 发表期刊：J Allergy Clin Immunol

外泌体已成为细胞间通讯中的重要角色。气道上皮细胞（AECs）是抵御外源抗原的第一道防线，然而，呼吸道上皮细胞（AECs）产生的外泌体是否参与哮喘的发生尚不清楚。研究者用屋尘螨（HDM）刺激的AECs分泌的外泌体或单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）（被HDM和/或CNTN1蛋白激活）处理小鼠，发现前者可以在细胞培养基和小鼠中促进moDCs的富集、增殖、迁移和激活。在哮喘疾病中，外泌体中的CNTN1是一个关键要素。RNAi介导的沉默和药物抑制剂实验证实Notch2受体是转导CNTN1信号从而激活Th2/Th17免疫反应的必要因素。对哮喘患者的队列研究也支持上述在细胞和小鼠模型中发现的CNTN1-Notch2 轴效应。
PBS-pAECs-EXO和HDM-pAECs-EXO上清中的外泌体（或BEAS-2B细胞）进行了LabelﾠFree蛋白质组学分析, 发现CNTN1 是重要的差异蛋白，在HDM-pAECs-EXO 上清外泌体中高表达。
CNTN1以Notch2信号依赖的方式诱导DCs激活，从而促进过敏性呼吸道炎症。

CNTN1以Notch2信号依赖的方式诱导DCs 激活，从而促进过敏性呼吸道炎症。
本研究表明，AECs分泌的外泌体参与调节DCs引发的过敏反应，在哮喘的发生发展中发挥关键作用。同时研究还进一步证实了，AECs-EXO携带的CNTN1蛋白通过Notch2信号通路诱导DCs活化，从而促进哮喘进程。靶向CNTN1可利用免疫系统的先天和适应性“手臂”来抑制呼吸道炎症。CNTN1可作为潜在的生物标志物，可能成为诊断和治疗过敏性呼吸道炎症的新策略。