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文献和实验
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库存 :50
英文名 :Guanarito Virus(GTOV)
保质期 :一年
供应商 :上海博尔森生物科技有限公司
保存条件 :-20℃
规格 :50次
瓜纳瑞托病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒
产品名称:Guanarito Virus(GTOV)
规格:50T/盒
【产品简介】:
瓜纳瑞托病毒该RT-PCR试剂中的耐热反转录酶具有卓越的热稳定性,在55℃条件下仍然保留90%以上的聚合活性。制品中的Fast Taq DNA聚合酶采用专有的热启动技术确保55℃以下没有任何活性,因此可在室温建立反应体系。Fast Taq DNA聚合酶具有卓越的扩增速度,因此满足快速PCR程序,通常在30min以内可以完成扩增反应。同时该聚合酶具有耐受杂质的能力,同样适用于粗制核酸样本的扩增反应,其检测结果仅供参考。本产品不提供活体样品做阳性对照,仅提供人工合成的特异性DNA片段标准品作为阳性对照,仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗用途。
【检验原理】:
本试剂盒采用TaqMan探针法实时荧光PCR技术,设计一对瓜纳瑞托病毒特异性引物,结合一条特异性探针,用一步法荧光RT-PCR技术对瓜纳瑞托病毒的核酸进行体外扩增检测。
【PCR实验常见问题】为何空白对照会出现目的扩增产物(假阳性)?如何避免?
空白对照出现目的扩增产物,属于出现了靶序列或扩增产物的交叉污染,为避免这种情况发生,应注意以下几点:(1)实验操作时小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。(2)除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。(3)各种试剂最好先进行分装,然后低温贮存。
【PCR实验常见问题】无扩增产物(假阴性)的可能原因及解决方法有哪些?
可能原因 | 解决方法 |
模板含有抑制物或模板含量低 | 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 |
Buffer对样品不合适 | 更换Buffer或调整浓度 |
引物设计不当或者发生降解 | 重新设计引物(避免链间二聚体和链内二级结构)或者换一管新引物 |
反应条件:退火温度太高,延伸时间太短 | 降低退火温度、延长延伸时间 |
编号 | 成分 | 规格 |
试剂一 | 瓜纳瑞托病毒扩增液 | 50μL×1管 |
试剂二 | 瓜纳瑞托病毒反应液 | 950uL×1管 |
试剂三 | 瓜纳瑞托病毒阳性质控品(5.59E+04) | 50μL×1管 |
试剂四 | 瓜纳瑞托病毒阴性质控品 | 50μL×1管 |
产品说明书 | 1份 | |
注:
|
1.试剂盒应置于-15℃以下冷冻避光储存;有效期12个月,采用泡沫盒加生物冰袋密封运输,温度不超过8℃,生产日期及有效期详见外包装盒。
2.试剂盒避免反复冻融,冻融次数不超过5次,开封后-15℃以下冷冻避光储存,不影响有效期内使用。
【适用仪器】:
ABI、安捷伦MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列荧光定量PCR检测仪。
【标本采集】:
1.根据实际情况可采取病毒/组织/血液等样品1g作为检测样本
2.应避免样本间交叉污染,样本采集后应及时检测,也可保存于-20±5℃待检,长期保存应置于-70℃以下。
【样本保存及运输】:
上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过6个月,标本运送应采用2~8℃冰袋运输,严禁反复冻融。
【使用方法】:
1.样品处理(样本处理区)
1.1样本前处理
1)组织样品:每份组织分别从3个不同的位置称取样品约1g,手术剪剪碎混匀后取0.5g于研磨器中研磨,加入1.5mL生理盐水后继续研磨,待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中,8000rpm离心2min,取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中;
2)全血样本:待血凝固后,取血清100μL于1.5mL灭菌离心管中。
1.2核酸(RNA)提取
根据您实验室的具体情况和样品类型,选择适当的提取策略方法。为了使实验结果稳定、有效、可靠,我们建议使用商品化病毒DNA/RNA提取试剂盒进行提取,严格按照对应试剂盒说明书进行操作,样本核酸提取过程中应避免污染,提取好的模板样品如不能立即检测,建议-15℃以下保存。
推荐采用我们公司研发生产的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒
2.试剂配制(试剂准备区)
2.1从-15℃以下冰箱中取出试剂盒平衡到室温(20~25℃),注意避免强光照射,待完全溶解后振荡混匀并低速离心10 s,使用低吸附吸头分液取样,避免试剂损失和浪费。
2.2根据待检测样本总数,设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照;样品每满7份,多配制1份),每测试反应体系配制如下表:
试剂 | 瓜纳瑞托病毒反应液 | 瓜纳瑞托病毒扩增液 |
用量(样本数为N) | 19μL | 1μL |
2.4盖紧八联PCR反应管盖,并注意做好相应标识(请标记在八联PCR反应管盖两端突出部位,切勿标记在八联PCR反应管盖中间,以免影响信号采集)。将PCR反应管转移至样本准备区,剩余试剂放回-15℃以下冰箱冷冻保存。
3.加样(样本处理区)
将步骤1.2提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取5μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,短暂离心,核酸加样过程中应避免污染。
4.PCR扩增(核酸扩增区)
4.1将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内,并记录放置顺序;
4.2设置好通道、样品信息,反应体系设置为25μL;
4.3荧光通道选择:检测通道选择FAM,淬灭通道选择NONE,参比荧光选NONE。
【推荐循环参数设置】:
步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 | 收集荧光信号 |
1 | 1 cycle | 50℃ | 15min | 否 |
2 | 1 cycle | 95℃ | 3min | 否 |
40 cycles | 95℃ | 15sec | 否 | |
55℃ | 30sec | 是 |
5.1结果分析条件设定
设置Baseline和Threshold:一般直接按机器自动分析的结果分析,当曲线出现整体倾斜时,根据分析后图像调节Baseline的start值(一般可在3~15范围内调节)、stop值(一般可在5~20范围内调节),以及Threshold的Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照),重新分析结果。
5.2结果判断
l阳性:检测通道Ct值≤35.0,且曲线有明显的指数增长曲线。
l可疑:检测通道Ct值>35.0,且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验,重复试验结果出现Ct值≤38.0和典型扩增曲线者为阳性,否则为阴性。
l阴性:检测结果Ct值无Ct值,无明显的扩增曲线。
6.【质控标准】
l阴性质控品:无明显扩增曲线或无Ct值显示;
l阳性质控品:扩增曲线有明显指数生长期,且Ct值≤30;
l以上条件应同时满足,否则实验视为无效。
7.【产品性能指标】
l阴阳性参考品符合率:5份阳性参考品符合率为100%;10份阴性参考品符合率为100%。
l最低检测限:1.0×103copies/mL。
l精密度:批内、批间精密度检测Ct值的变异系数(CV)均小于等于3%。
【厂家信息】:
Ø 公司名称:上海博尔森生物科技有限公司
Ø 网址:www.bioesn.net
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
上海博尔森生物科技有限公司
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