双荧光素酶报告基因检测

提供商 ：佰欧晶医学

服务名称 ：双荧光素酶报告基因检测

规格 ：次（RNA）/次（启动子）

荧光素酶（英文名称：Luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的是一种学名为Photinus pyralis的萤火虫体内的荧光素酶。在相应化学反应中，荧光的产生是来自于萤光素的氧化，有些情况下反应体系中也包括三磷酸腺苷(ATP)。没有荧光素酶的情况下，萤光素与氧气反应的速率非常慢，而钙离子的存在常常可以进一步加速反应（与肌肉收缩的情况相似）。

   双荧光素酶报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测，通常一个报告基因作为内对照，使另一个报告基因的检测均一化。检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。

通常实验报告基因偶联到调控的启动子，研究调控基因的结构和生理基础。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照，使测试不被实验条件变化所干扰。
   通过这种方法，可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性，比如，培养细胞的数目和活力的差别,细胞转染和裂解的效率。理想的双报告基因方法应该使用户能够以萤火虫荧光素酶所具有的速度,灵敏和线性范围对同一样品中的两个报告基因同时测定。

   这在传统的报告基因，如CATB-Gal和GUS是不可能的，由于它们测试化学,处理要求所固有的局限。相反，结合萤火虫(Photinuspyralis)和海洋腔肠(Renilla reniformis)双荧光素酶的系统可满足这些要求，在单管中完成这些测试。
   双荧光素酶报告基因系统实验原理为：双萤光素酶报告基因载体上含有两种荧光素酶基因，分别是萤火虫荧光素酶基因和海肾荧光素酶基因，二者没有序列同源性，并且分别对应各自的反应底物，消除了实验过程中的干扰。在检测的过程中，由于miRNA主要作用于靶基因的3'UTR，所以将靶基因mRNA的3'UTR和定点突变靶点的片段插入至双荧光素酶基因载体下游的多克隆位点(MCS)中，并将构建好的重组载体质粒与miRNA或miRNA 模拟物(miRNA mimics)共转染到工具细胞中，检测萤光素酶的活性变化，从而可以定量反映miRNA是否对潜在靶基因起作用。以此来确定转染载体中是否含有miRNA的靶位点。