中东呼吸综合征冠状病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

库存 ：50

英文名 ：Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus(MERS-CoV) SYBR qRT-PCR Kit

保质期 ：一年

供应商 ：上海博尔森生物科技有限公司

保存条件 ：-20℃

规格 ：50次

【产品名称】中东呼吸综合征冠状病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒
【包装规格】50T/盒

【预期用途】
中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus，MERS-CoV)是一种RNA病毒，会引发中东呼吸系统综合征，是2012年9月发现的一种由新型冠状病毒引起的急性呼吸道疾病。该病毒首现于沙特，继而在中东其他国家及欧洲等地区蔓延，近期韩国也报告了病例，并引起进一步传播。该病目前主要临床表现为：发热、咳嗽、呼吸急促和呼吸困难等急性重症呼吸道感染症状，部分病例会出现肾功能衰竭，小部分病例仅表现为轻微呼吸道症状或无症状，给人体健康带来较大的风险，因此中东呼吸综合征冠状病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。本产品基于PCR原理开发。它具有下列特点：
1.一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。
2.根据中东呼吸综合征冠状病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。
3.基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10-100倍，可以达到至少1000拷贝/反应。
4.使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
5.本产品足够50次30μL体系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。
【检验原理】
本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术，针对中东呼吸综合征冠状病毒的基因高度保守区域设计特异性引物，用荧光 PCR 技术对中东呼吸综合征冠状病毒的核酸进行体外扩增检测，在反应体系中含中东呼吸综合征冠状病毒核酸模板的情况下，PCR 反应得以进行并释放荧光信号，利用仪器对 PCR 过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性、定量分析。
【试剂组成】

名称	规格
中东呼吸综合征冠状病毒扩增液	100μL×1管
中东呼吸综合征冠状病毒反应液	900μL×1管
中东呼吸综合征冠状病毒阳性质控品	50μL×1管
阴性质控品	50μL×1管
说明书	1份

说明：1）不同批号的试剂盒组分不可交互使用。2）试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

1. 自备：无 DNA/RNA 酶的 1.5mL 离心管，0.2mL PCR 反应管，滤芯吸头(规格:10μL，200μL，1000μL)，离心机，振荡混合器，各种规格的移液器。

【储存条件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融少于 7 次，有效期 12 个月。
【自备物品及仪器】
ABI 、MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【样品采集】
1. 根据实际情况可采取采取全血、血清、血浆，口腔样本，唾液、咽喉部鼻孔眼部和病毒培养物作为检测样本，具体参考《临床微生物样本采集规范》。
2. 应避免样本间交叉污染，样本采集后应及时检测，也可保存于-20±5℃待检，长期保存应置于-70℃以下。
【样品保存和运输】
上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。
【使用方法】
1.样品处理（样本处理区）
取待检测样本 200ul，加入 1.5ml 离心管中，用 DNA 核酸提取试剂盒进行提取即可。
1.2 RNA 提取
根据您实验室的具体情况和样品类型，选择适当的提取策略方法。为了使实验结果稳定、有效、可靠，我们建议使用商品化的试剂盒进行提取，严格按照对应试剂盒说明
书进行操作，样本核酸提取过程中应避免污染，提取好的模板样品如不能立即检测，建议-15℃以下保存。推荐采用我们公司研发生产的 RNA 提取试剂盒：RaPure 病毒RNA提取试剂盒
2. 试剂配制（试剂准备区）
2.1 从-15℃以下冰箱中取出试剂盒平衡到室温（20～25℃），注意避免强光照射，待完全溶解后振荡混匀并低速离心 10 s，使用低吸附吸头分液取样，避免试剂损失和
浪费。
2.2 根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂	中东呼吸综合征冠状病毒反应液	中东呼吸综合征冠状病毒扩增液
用量（样本数为N）	19μL	1μL

2.3 在适当容积的无菌离心管中加入上述试剂，充分振荡混匀后 2000 rpm 离心 10 s，按照 20 μL/管分装量将试剂分装至八联 PCR 反应管中。
2.4 盖紧八联 PCR 反应管盖， 并注意做好相应标识（请标记在八联 PCR 反应管盖两端突出部位，切勿标记在八联 PCR 反应管盖中间，以免影响信号采集）。将 PCR 反
应管转移至样本准备区，剩余试剂放回-15℃以下冰箱冷冻保存。
3. 加样（样本处理区）
将步骤 1 提取的 RNA、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心，核酸加样过程中应避免污染。
4. PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择：检测通道 SG，荧光染料法(SYBR Green I)，请勿选择 ROX 参比荧光。
4.3 推荐循环参数设置：

步骤	循环数	循环数	温度	时间	收集荧光信号
1	预变性	1 cycle	50℃	15min	否
2	变性	1 cycle	95℃	3min	否
2	退火-延伸	40 cycle	95℃	15sec	否
			60℃	30sec	是
3	溶解曲线阶段	1 cycle	95℃	使用仪器默认程序	否

5. 结果分析判定
5.1 结果分析条件设定
设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。
5.2 结果判断
阳性：检测通道 Ct 值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线。
可疑：检测通道 Ct 值>35.0，且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验结果出现 Ct 值≤38.0 和典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性。
阴性：样本检测结果无 Ct 值且无明显的扩增曲线。
6. 质控标准
阴性质控品：无明显扩增曲线或无 Ct 值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤30；
以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
7. 产品性能指标
阴阳性参考品符合率：5 份阳性参考品符合率为 100％；10 份阴性参考品符合率为 100％。
最低检测限：1.0×103copies/mL。
精密度：批内、批间精密度检测 Ct 值的变异系数（CV）均小于等于 3%。
8. 检测方法的局限性
Ø 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
Ø 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
Ø 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
Ø 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
Ø 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
Ø 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果。
9. 注意事项
Ø 所有操作严格按照说明书进行；
Ø 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，混匀并短暂离心；
Ø 反应液应避光保存；
Ø 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
Ø 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
Ø 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
Ø 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
Ø 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
【厂家信息】：
Ø 公司名称：上海博尔森生物科技有限公司
Ø 网址：www.bioesn.net



特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！