细胞周期检测

提供商 ：佰欧晶医学

服务名称 ：细胞周期检测

规格 ：每孔

一、实验目的
通过检测细胞内DNA含量的变化，检测外界干预手段对细胞生长周期的影响。
二、实验原理
细胞周期（cell cycle）：是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1 期、S 期、G2/M 期组成。G0/G1 期：二倍体细胞的DNA 含量(2N)。S 期：DNA 开始合成，这时细胞核内DNA 的含量介于G1 期和G2 期之间。G2/M 期：DNA 复制结束成为4 倍体（4N)。
碘化丙啶(Propidium, PI)PI 为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA 或RNA 双链螺旋的碱基之间，产生红色荧光，并且荧光强度和所嵌入的核酸含量成正比。细胞周期检测时，首先用RNA 酶将RNA 消化排除影响，通过流式细胞术检测PI 荧光强度直接反映细胞各时相的DNA 分布状态，从而计算出各时相的百分率。
三、实验步骤
 1. 细胞样品的准备：待各实验组细胞融合度达到70%，用胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入含有血清的完全培养基终止消化，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000g左右离心3分钟，沉淀细胞。小心吸除上清。加入1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5毫升离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
 b. 对于悬浮细胞：收集细胞到离心管内，1000g左右离心3分钟，沉淀细胞。小心吸除上清，加入1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5毫升离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
2. 细胞固定：加入1毫升冰浴预冷70%乙醇，轻轻吹打混匀，4℃固定过夜。1000g左右离心3分钟，沉淀细胞。小心吸除上清，加入1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
3. 碘化丙啶染色液的配制：参考下表，根据待检测样品的数量配制适量的碘化丙啶染色液，现配现用：

	1个样品	6个样品	12个样品
RNase A (50X)	10ul	60ul	120ul
碘化丙啶染色液(25X)	20ul	120ul	240ul
染色缓冲液	470ul	2.82ml	5.64ml
Final volume	500ul	3.0ml	6ml

1. 染色：每管细胞样品中加入0.5毫升碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀， 37℃避光温浴30分钟。

5. 流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。