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文献和实验
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库存 :-
英文名 :-
CAS号 :-
保质期 :-
供应商 :东盛生物
保存条件 :-20℃
规格 :5000U/10000U
货号/规格:R1041/5,000U, R1042/10,000U产品说明
M-MLV逆转录酶是由一个 71 kD的单亚基组成的重组型DNA逆转录聚合酶。可以催化以RNA或DNA:RNA杂交链为模板的互补DNA 的聚合反应。本酶经修饰RNase H活性比普通的逆转录酶要弱很多,因此在合成第一链cDNA的过程中,可保证RNA的降解程度较低,从而使得率提高。
产品组分
组分 | R1041 | R1042 |
M-MLV (200U/μl) | 25 μl | 50 μl |
5× first-strand buffer | 100 μl | 200 μl |
M-MLV 储存液成分
20 mM Tris-HCl (pH 7.5),200 mM NaCl,0.1 mM EDTA,1 mM DTT,0.01% NP-40,50% glycerol
5x first-strand buffer 成分
250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃),375 mM KCl,15 mM MgCl2,50 mM DTT
保存条件
-20℃保存,避免反复冻融。
质量检测
逆转录酶活性检测
使用[32P]dCTP作为标记,200 U的M-MLV以1μg、1.2 kb的RNA为模板进行逆转录反应,最低可得到120 ng的cDNA,所得cDNA长度 > 全长的90%。
核酸外切酶活性检测
混合50 ng的标记DNA或RNA与200 U M-MLV在1×反应缓冲液体系中,37℃温浴1 h,检测DNA和RNA降解都不到总量的1%。
核酸内切酶活性检测
混合1μgⅠ型超螺旋质粒DNA与500 U M-MLV在1×反应缓冲液体系中,37℃温浴1 h,琼脂糖电泳检测,无明显的剪切。
适用范围
第一链cDNA 合成;cDNA 文库构建;RT-PCR;引物延伸;3' 和 5' RACE。
注意事项
- 成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长的完整性并且不含逆转录酶的抑制剂,如EDTA或 SDS。用于cDNA合成反应的溶液试剂尽可能用DEPC进行处理,并在高压灭菌后使用。有些试剂不能用高压灭菌处理时,首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后,再将溶液进行过滤除菌处理。
- 为了增加贮存RNA样品的稳定性,可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中,存于-70℃。用于保存 RNA 的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时,可以使用下列方法沉淀RNA:加入NaCl至0.2 M同时加入4倍体积的乙醇,室温放置3-5 min,10,000 rpm离心5 min。
- 在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂(RNasin)以增加cDNA合成的长度和产量。在第一链合成反应中,RNase抑制剂在缓冲液和还原剂(如 DTT)存在的条件下加入,因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性,从而释放出RNase。但是RNase抑制剂仅防止RNase A,B,C 对RNA的降解,并不能防止皮肤上的RNase,因此尽管使用了RNase抑制剂,也要小心不要从手指上引入RNase。
- 较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开,增加反应的产量。
- 使用简单的RNA纯化方法即可获得满足RT-PCR反应的RNA,但为了保证实验的成功率,建议使用GTC法制备的高纯度RNA。
- 为防止RNA降解,应尽量避免反复冻融,最好保存于-70℃。
- 最佳的PCR反应条件,因PCR扩增仪的不同而不同,所以在使用您的样品之前最好先试做一下control反应,以确定最佳的PCR反应条件。
- cDNA产物应置于-20℃保存。
- 当以cDNA为模板进行PCR之前,使用RNase H处理cDNA,可以提高PCR反应的灵敏度。
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