顺乌头酸酶(ACO)科研专用测试盒/可见分光光度法

保存条件 ：低温保存

保质期 ：6个月

英文名 ：ACO测试盒

库存 ：597

供应商 ：上海机纯实业有限公司

规格 ：50管/48样

注　意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
顺乌头酸酶（aconitase），三羧酸循环中的酶，催化柠檬酸转变为异柠檬酸。柠檬酸本身不易氧化，在顺乌头酸酶作用下，通过脱水与加水反应，使羟基由β碳原子转移到α碳原子上，生成易于脱氢氧化的异柠檬酸，为进一步的氧化脱羧反应作准备。

测定原理：
ACO 催化柠檬酸转化成异柠檬酸，异柠檬酸氧化脱羧将 NAD+ 还原生成 NADH，导致 340nm 处光吸收上升。

需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：
试剂一：50mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：10mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：1mL×1 支，-20℃保存；
试剂四：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；
试剂五：液体 5mL×1 瓶，4℃保存；
试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存；临用前加 3mL 蒸馏水充分溶解；现配现用
试剂七：粉剂×1 支，4°保存；临用前加 36mL 试剂四充分溶解；
工作液：临用前在 36mL 试剂七中加入 3mL 蒸馏水、3mL 试剂四、3mL 试剂五、3mL 试剂六充分混匀

样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、将匀浆转入离心管内 600g，4℃离心 5min。
3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
4、上清液即胞浆提取物，可用于测定胞质顺乌头酸酶活性。
5、在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体顺乌头酸酶活性测定。



测定步骤
1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、样本测定
（1）将工作液，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min；现配现用；若分次用将工作液分装后于-20°保存，一星期内可用。

（2）在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 样本 900μL 工作液，混匀，立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 3min20s 后的吸光值 A2，计算ΔA=A2-A1。