蛋白印迹western-blotting

提供商 ：湘元生物

服务名称 ：蛋白印迹western-blotting

（WB流程图）

操作流程：

wb实验常规实验流程包括：蛋白提取→蛋白定量→制胶→电泳→转膜→封闭→一抗孵育→一抗洗脱→二抗孵育→二抗洗脱→化学发光→数据分析。
 

wb实验之电泳操作步骤如下：

 

1、剪开包装取出预制胶，撕去胶板底端蓝色胶带，然后拔出梳子，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满电泳缓冲液，注意，这个外槽液体加入量要高于电泳槽高度1/3。
 

2、在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液，水浴溶解后立即室温存放。
 

3、每4 μL蛋白样品中，加入1 μl 5XSDS-PAGE的蛋白上样缓冲液，混匀。

 

4、100℃或沸水浴加热 3-5 分钟，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。
 

5、接着在每个样品孔中上样10-30 μg蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，跑个30-40分钟。
 

6、电泳结束，取出凝胶。

 

wb实验之转膜与封闭操作步骤如下：

 

1、将胶浸在预冷的转膜缓冲液中5分钟。

 

2、依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10 分钟。

 

3、海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵（三明治），每层放好后，然后可以用试管把气泡弄掉。

 

4、将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液。

 

5、转膜结束后，切断电源，取出膜。

 

6、将膜浸没在5 mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10分钟或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

 

7、清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5分钟。

 

8、脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5分钟；倒去洗脱液，再重复一次。

 

9、清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5分钟。

 

10、将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

 

11、用5mL TBST洗涤三次，每次15分钟。

服务特点：

高效分离：高分辨率的电泳技术分离总蛋白，达到更高的灵敏度；
特异敏感的免疫反应：抗原-抗体的结合是由于在化学结构和空间构型上呈互补关系，具有高度特异性；
检测灵敏：可检测到低至1～5ng（最低可到10～100pg）中等大小的靶蛋白；

服务说明：

请提供足量的检测样本（组织>100mg，细胞>107个）及检测用一抗；亦可委托本公司代购抗体或者定制抗体；
由于预实验需要，建议同时提供相应阳性对照；
请提供待测蛋白信息，包括蛋白种属、性质、大小等。

交付标准：

蛋白检测原始胶片
完整实验报告一份
剩余的样本和一抗

服务流程：
 

关于我们-湘元生物

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