人CIK细胞培养基套装（一类医疗器械备案产品）

品系 ：CIK

细胞类型 ：人CIK细胞培养基套装

肿瘤类型 ：适用于直肠癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、淋巴癌、白血病、多发性骨髓瘤、恶性黑色素瘤等多种肿瘤的细胞免疫治疗临床研究

供应商 ：自主研发生产

库存 ：10万套

英文名 ：Clin-SFM-Human CIK

生长状态 ：NK92细胞生长良好

年限 ：20年细胞培养基研发生产经验

运输方式 ：冷藏

器官来源 ：外周血、胎盘/脐带血或骨髓单个核细胞

是否是肿瘤细胞 ：否

细胞形态 ：悬浮培养

免疫类型 ：人CIK细胞

物种来源 ：外周血、胎盘/脐带血或骨髓单个核细胞

相关疾病 ：适用于直肠癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、淋巴癌、白血病、多发性骨髓瘤、恶性黑色素瘤等多种肿瘤的细胞免疫治疗临床研究

组织来源 ：外周血、胎盘/脐带血或骨髓单个核细胞

规格 ：1000mL×2(含激活剂1支，重组人IL-15 1支)

Clin-SFM-Human CIK ,人CIK细胞培养基是一种化学成分明确、无人和动物血清、无任何动物成分的培养基，适用于人外周血、脐带血骨髓等来源NK 细胞的培养扩增。产品中所有蛋白质成分均为重组技术获得，包括重组人白蛋白、重组人转铁蛋白等多种成分。产品不含任何抗生素。激活剂为特异性活化NK细胞而设计。激活剂中含有特殊的活性物质，鲎试剂法测定热源为阳性(>0.5U/ml，鲎试剂法)。然而，在培养过程中，该成分不会存在于细胞终产品中，因此，细胞产品热源测定应为阴性。使用该套装，培养起始细胞可以为外周血、胎盘/脐带血或骨髓单个核细胞。一般而言，使用该套装培养14 天，细胞总数扩增 100 倍以上，CIK比例可达到 50%。激活剂 4℃储存，有效期6个月。人NK 优势扩增培养基需 4℃ 储存，有效期 12 个月。所有成分均应避光保存，不宜剧烈震荡，以免大分子物质因变性而失活。 本操作方法以采集外周血30ml为例，介绍CIK细胞诱导扩增培养的具体方法。请仔细阅读操作手册，尤其注意每个提醒事项。

1. 培养瓶包被

1. 建议使用适于贴壁细胞培养的培养瓶。
2. 将激活剂（2ml）置于37°C复温10分钟，轻轻混匀。
3. 培养瓶（75cm2）加入激活剂2.0ml，之后加入生理盐水或PBS 8ml，混匀。将培养瓶置于4°C过夜，或置于37°C，2小时以上。

注意事项：我们自己的实验证明，4°C过夜优于37°C包被2小时。包被的培养瓶可置于 4°C，一周内使用。

1. 单个核细胞分离、血浆采集及处理

1. 开启水浴箱，调整温度至56°C，以备灭活补体用。
2. 常规无菌采集抗凝外周血，肝素抗凝。
3. 常规密度梯度离心法，离心（800g， 30分钟），收集单个核细胞。
4. 吸取上层血浆，56°C，30分钟灭活补体。之后，将含血浆的离心管置于-20°C，5分钟。离心（3000g，至少15min）以彻底去除血小板。
5. 收取单个核细胞层，生理盐水或培养基充分混匀。离心洗涤（500g，10min）。
6. 生理盐水或培养基悬浮细胞沉淀，再次离心洗涤（500g，8-10min）。
7. 使用CIK细胞扩增培养基悬浮细胞。
8. 取10ul细胞悬液，加入白细胞稀释液90ul，混匀后计细胞数。将细胞浓度调整为3×10^6/ml。

1. 细胞培养

1. 取出已经包被且置于37°C孵育的培养瓶，吸净稀释的激活剂。沿培养瓶侧壁加入少量生理盐水，轻轻洗涤瓶底。吸除。
2. 根据细胞计数结果，将细胞终浓度调整为3×10^6/ml。单个核细胞悬液中加入IFN-gamma（2000U/ml）及自体血浆，自体血浆浓度为2.5%-5%。

 

培养瓶（底面积）	25cm2	75cm2
原CIK激活剂总体积	1ml	2ml
细胞悬液总体积	2.5-5ml	7.5-10ml
细胞总数	0.75-1.5*10^7	2-3*10^7

细胞浓度以及接种培养瓶的表面积，是决定最终培养CIK细胞比例的两个关键因素。我们推荐细胞密度在3*10^6/ml。同时，根据接种细胞体积选择适宜底面积的培养瓶。下表可作为参考。

1. 将细胞悬液加入培养瓶中，置于37 °C、5%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养。
2. 培养24小时后，加入重组人IL-2（500U/ml）和CIK激活辅助剂（1μl/ml）。
3. 继续培养。培养液变黄后补充新鲜培养基，新鲜培养基含血浆（2.5%-5%）和重组人IL-15（50ng/ml）。补液量一般为补液前原体积的1倍，也可根据细胞悬液颜色和细胞浓度，补充原体积的0.5倍。一般而言，细胞应在预铺板的培养瓶中培养至少一周。
4. 当原瓶培养基变黄、总体积接近或达到培养瓶最大体积时，补充新鲜的培养基，并分瓶培养。分瓶时，一定将贴壁的细胞转移至新的培养瓶。可以将细胞悬液转移后，在旧培养瓶中加入冷的生理盐水，静置于室温5分钟。之后，轻轻拍打培养瓶侧壁，吹打后转移至离心管收集细胞，平均分配于新的培养瓶中。
5. 补充新鲜培养基，含2.5%-5%血浆和IL-15。
6. 每天观察细胞集落大小及细胞密度，及时补充含血浆和IL-15的新鲜培养基，新鲜培养基总量与原来体积相同（等量补液）或为原体积的0.5倍。每次补液前，轻轻拍打培养瓶侧壁，使贴壁的集落悬浮。
7. 主要根据培养基颜色，每天或每隔1-2天补充新鲜的含血浆及细胞因子的CIK细胞扩增培养基。必要时再次转用新的培养瓶扩增。培养12-15天，细胞数达到目的用量后，可进行质量检验，检测合格后收获细胞。

1. 细胞收获

1. 将细胞转移至500ml离心管。
2. 在培养瓶中加入冷的生理盐水（30ml/225cm2），静置于室温5分钟。之后，轻轻拍打培养瓶侧壁，吹打后转移至离心管。
3. 计细胞数及细胞活力。
4. 离心收获细胞，500g，15min。
5. 将细胞转移至250ml离心管，生理盐水悬浮，离心洗涤，500g，15min。
6. 将细胞转移至50ml离心管，生理盐水悬浮，离心洗涤，500g，10min。
7. 用含1%注射用人白蛋白的生理盐水悬浮细胞。
8. 使用孔径为70μm的细胞筛过滤细胞。
9. 留小样备质检。
10. 将细胞转移至输液袋中。静置于室温。

5. 注意事项

1. CIK细胞来源于CD8阳性的细胞，在IFN-gamma作用下，单核细胞分泌IL-12以促使CD8阳性细胞分化为CD3+/CD56+细胞（CIK）。因此，在加入抗体和细胞因子之前，IFN-gamma作用时间不应低于24小时。
2. 细胞应尽可能在原培养瓶中培养，或尽可能延长在原培养瓶中的培养时间，以增加单核细胞与CD8阳性细胞接触的时间。这是决定CIK细胞培养是否成功的关键因素。将单个核细胞在原培养瓶中培养超过1周，常可达到较好的效果。