腺相关病毒载体在肺脏的研究及应用价格

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服务名称：腺相关病毒载体在肺脏的研究及应用服务

一、原理

腺相关病毒（Adeno-associated Virus，AAV）属于细小病毒科（parvoviridae），病毒颗粒无包膜，结构为直径约20nm的正二十面体，是迄今发现的一类结构最简单且无法自主复制的线性单链DNA病毒，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染力。通过人工进化的方法对AAV衣壳蛋白Cap基因进行定向突变改造，可以筛选到具有高转导效率和不同感染特性的AAV载体，极大增加了AAV的应用潜力。

研究中采用的重组腺相关病毒（Recombination adeno-associated virus,rAAV）载体是在非致病的野生型AAV的基础上改造的基因表达载体，具有种类多样、免疫原性低、安全性高、宿主范围广、扩散能力强、体内表达外源基因时间长等特点，已被广泛的应用在动物水平的基因表达、基因操作和基因治疗。

研究表明AAV5、AAV6和AAV9等对肺有较高的趋向性。目前，AAV已经应用于肺囊性纤维化的临床实验中。

rAAV所包含的DNA一般是用外源基因表达元件替换AAV的编码基因，仅保留了病毒复制和包装所需的ITR序列。通过反式补偿Rep基因、Cap基因和辅助病毒功能因子包装产生携带外源DNA的rAAV。rAAV的载体容量是4.7kb，插入外源目的片段大小不超过2.8kb。

表1.AAV靶向不同的器官及组织推荐使用对应血清型，注射方法及剂量

二、注射方法

肺部病毒感染常用的方法有系统注射（尾静脉注射或腹腔注射）、及鼻内或气管内递送（经呼吸道）等。

1）鼻内滴注

鼻内滴注法是一种直接的AAV感染法，操作简单且对设备要求低，对新手友好。但缺点是AAV颗粒容易沉积在上呼吸道（鼻道、鼻窦、咽）和胃肠道，如果需要有效地感染到下呼吸道，则可能需要更大剂量的AAV才能实现。

2）内镜辅助口腔气管插管手术

内镜气管插管术能够将AAV直接灌入肺中，无外科手术风险，且避免了上呼吸道的病毒颗粒损失。由于几乎所有AAV病毒颗粒都会到达肺内，所以要严格控制AAV的使用量。同时，与鼻内滴注法相比，口腔气管插管术需要一些特殊设备，操作起来也稍有难度。

3）气管内注射

与鼻内滴注相比，气管内注射能够提高AAV进入肺部的效率；而与口腔气管插管法相比，设备更简单，操作更容易。但是，气管内注射具有极高的外科手术风险，包括出血、切口开裂、感染以及较长的恢复期等。不仅如此，由于小鼠气管窄小，也很容易出现失误，将AAV注射到气管周围组织或食管中去。

三、应用案例

1）

（病毒载体为AAV6.2FF-CMVenh（人巨细胞病毒即刻早期基因增强子区）-Luc）

（AAV6.2FF-CMV-emGFP-nls-Cre注入Rosa26-Flox/LacZ报告小鼠）

参考文献：Kang MH, van Lieshout LP, Xu L, et al. Nat Commun. 2020.

2）

8-10周龄C57BL/6小鼠通过鼻吸导入AAV6-CAG-AP载体，1个月后取肺组织AP染色，结果显示鼻腔上皮细胞、支气管气道上皮细胞、远端气道上皮细胞均被高效转导，且肺的大部分区域几乎所有肺泡细胞也都被染色，从而实现了从鼻腔上皮到远端肺泡的强力转导。

参考文献：Halbert CL, Lam SL, Miller AD. Hum Gene Ther. 2007.

3）

IL10对博莱霉素诱导肺纤维化的抗炎和抗纤维化作用

10-12周龄，体重25-30g的雄性C57BL/6J小鼠第0天气管内注射AAV6-CAG-IL10或缓冲液对照，第7天皮下植入渗透微型泵连续一周给125mg/kg博莱霉素（BLM）或生理盐水，小鼠随机分为Group1（无载体+生理盐水）、Group2（IL10过表达+生理盐水）、Group3（无载体+BLM）及Group4（IL10过表达+BLM）4组，并于第35天（BLM处理结束3周后）进行分析。左肺组织切片H&E染色，结果表示Group3中观察到细支气管周围和血管周围有中度至重度炎症浸润，相比之下，Group4中炎性细胞浸润减少，Group1和Group2中都没观察到明显炎症反应。Masson三色染色结果表明Group3小鼠胸膜下区域的肺泡结构破坏和肺间质纤维化，出现明显纤维化变化，同样的Group4小鼠肺纤维化变化减少，且Group1和Group2小鼠肺组织中几乎没观察到纤维化表现。通过Ashcroft纤维化评分进行量化发现AAV6-CAG-IL10的预处理可明显降低评分，即表示能改善BLM诱导的肺部纤维化损伤。

为评估AAV6-CAG-IL10载体对博莱霉素诱导炎症反应的影响，第35天获取小鼠BALF（支气管肺泡灌洗液）并行细胞分析，结果显示Group3和Group4中炎症细胞如巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞数量明显比Group1和Group2中多，而AAV6-CAG-IL10的预处理不影响BALF中的炎性细胞。博莱霉素处理小鼠无论是否IL10基因传递，BALF的总细胞数和细胞分类数量是相似的。