CRISPR-Cas9基因敲除服务价格_品牌:-丁香通官网

提供商：BrainVTA

服务名称：CRISPR-Cas9基因敲除服务

一、原理介绍

CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9）系统是目前被广泛运用的基因编辑系统，其原理是由CRISPR转录产生的sgRNA(small guide RNA)识别并结合目标基因的靶向序列，引导Cas9对结合位点进行剪切，产生DNA双链断裂（double-strand break，DSB），机体自身通过非同源末端重组（non-homologous end joining，NHEJ）的方式修复DSB，参与修复的蛋白经常会在DNA末端插入或删除几个碱基，修复后的基因由于产生突变而导致功能丧失，从而实现机体内的基因敲除（Gene Knockout）。

图1.CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑（Wiles MV,et al.Mamm Genome,2015）

图2.非同源重组修复DSB（Wiles MV,et al.Mamm Genome,2015）

二、应用实例

1.利用CRISPR/Cas9去除HBV感染（Zhen S, et al.Gene Ther.2015）

图3.靶向HBV基因组不同位置的gRNA

图4.靶向S基因的gRNA-S1和靶向X基因的gRNA-X3介导Cas9对HBV基因组的编辑产生突变，被T7E1错配酶识别

图5.Cas9和gRNA-(S1+X)共转至HBV转基因小鼠模型，能持续抑制血清中乙肝标志性抗原（HBsAg）的含量

2.利用CRISPR/Cas9进行基因治疗（Maeder ML, et al.Nat Med.2019）

莱伯氏先天性黑曚10型是一种单基因遗传病，是由于CEP290基因第26号和第27号外显子之间的突变造成mRNA错误剪接从而导致蛋白质缺失引起的，基因治疗公司Editas利用AAV载体表达SaCas9和靶向突变位点两端的gRNA，在体对CEP290基因进行编辑，删除突变的内含子序列或造成该区域翻转从而破坏错误的剪接位点，帮助形成正确的mRNA。

3.利用CRISPR/Cas9技术构建肿瘤模型（Maresch R, et al.Nat Commun.2016）

超过90%的人胰腺癌有KRAS突变，利用Ptf1a-Cre在胰腺特异诱导KRAS G12D突变基因表达,能诱导小鼠产生胰腺癌，但所需时间长达数月甚至一年以上。利用CRISPR-Cas9基因编辑在上述小鼠模型体内同时突变15个与胰腺导管腺癌（PDAC)相关的基因，可快速诱导PDAC产生，诱导成瘤中位时间为10周左右，到第24周，约54%的基因编辑小鼠能产生肿瘤。

三、我司提供病毒载体及细胞系构建服务

服务内容

1、sgRNA的设计；

2、细胞内sgRNA剪切活性筛选；

3、敲除载体的构建；

4、依据所要编辑的细胞选择Cas9和sgRNA不同导入方式：

a、脂质体易转染细胞：使用质粒系统（Cas9和sgRNA）；
b、脂质体难转染细胞：使用质粒系统电转化、慢病毒或腺相关病毒感染（Cas9和sgRNA）；

5、筛选基因敲除单克隆细胞系。

服务流程

需客户提供

1、目的基因序列（ID）以及物种来源；
2、需介导基因敲除的细胞（可选）；
3、病毒类型选择以及要求；
4、血清型选择。

表1.服务信息及最终交付内容、产品

流程分布	周期 (工作日)	交付内容	交付产品
sgRNA序列的设计	2-4周	sgRNA设计分析报告	-
sgRNA的活性筛选	2-4周	获得有活性的sgRNA及筛选报告	-
基因敲除质粒的构建	1周	基因敲除质粒报告	基因敲除质粒
病毒包装	3周	病毒包装报告	高纯度病毒
单克隆细胞分选	8周	单克隆细胞分选及检测结果报告	基因敲除单克隆细胞系