SEC 层析技术在原料质控（纯化工艺内控）方面的应用

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SEC 层析技术在原料质控（纯化工艺内控）方面的应用
抗原抗体及酶的活性质量对后期诊断检测效果的灵敏度起到关键作用，而衡量活性或质量的一个重要因素是其聚合状态和降解情况。比如，在研究酶活时，发现其活性是依赖于ニ聚体状态，那么可以通过检测二聚体的比率来判断整个酶的纯化工艺中其活性组分的含量。此时， SEC （又称体积排阻层析、分子筛、凝胶过滤）层析技术可以很好的被应用于聚合状态和降解情况的分析检测，实现对每步纯化工艺的内控和整体纯化终产品的质控。
 SEC 的原理非常简单，即其填料颗粒本身内部具有大小不同的孔道，当大小不同的物质经过该填料时，物质越大则越早出峰，反之越小则越晚出峰，这样就可以根据物质的大小或者说分子量的差异将其进行区分，原理如右图。因此，该技术非常适合分离单体、聚集体和降解片段。
但是，因为不同类型的填料其孔道大小分布范围不同，因此其适合分离的分子量范围也不同，以球蛋白为例，现在最经典且分离效果较优的有如下四款层析填料：


选择合适的分离范围对于分离效果非常重要，一般越靠近分离范围的中间，其在该范围内的分离效果越佳。当然，除了分离范围选择的合适与否，还有一些其它层析条件可能会影响到分离的效果，比如：流速、样品粘度、上样量等，其中上样量如果用于检测分析或者说精细分离，推荐上样柱体积的0.5%-4%。这就涉及到了选择不同体积的预装柱。 Cytiva 提供三种柱型满足不同的分析检测需求，如下图：

这三种柱型各有特色，10/300（内径10mm，柱床高度300mm）最为常见，其上样量推荐为500uL，基于其极高的分辨率和较大的上样量，因此不仅可以用于分析，而且兼具小规模制备。3.2/300（内径3.2mm，柱床高度300mm）是典型的分析柱型，其上样量推荐为50uL，分辨率极高。5/150（内径5mm，柱床高度150mm）从分辨率上看比10/300和3.2/300低一些，但是速度快，过一个柱体积只需7min，特别适合高通量的分析检测，比较推荐于快速检测分析聚合状态和降解情况。如下图1是使用 Superdex 200 Increase 5/150 GL 预装柱，对抗体的聚集体进行快速检测。单次检测时间为4分钟，能检测出20.1%聚集体。因此，这根预装柱可以作为抗体的筛选及评价中非常实用的工具。图2展示的 Superdex 75 Increase 5/150 GL 预装柱用于检测某蛋白稳定性的情况，在不同的存储条件下，不同时间段（以周为单位），蛋白会出现不同程度的降解。