sgRNA文库筛选

1.设计合成sgRNA文库
对于高通量筛选，文库的大小是影响筛选结果的关键因素之一。全基因组文库通常包含超过10万个sgRNA，一方面可以识别更多感兴趣的基因，但另一方面也会耗费大量时间和金钱（艾迪基因一般使用张峰的人类全基因组文库）。
对于其他相关通路基因则可以选择合成混合文库或者阵列文库。
2.构建稳定表达cas9蛋白的相应细胞株
3.慢病毒载体的构建及感染宿主细胞
CRISPR/Cas9高通量文库筛选方法中，最关键的步骤是构建慢病毒载体。将sgRNA文库进行慢病毒包装，并以较低的病毒感染复数转导至Cas9表达细胞系，确保每个细胞只进入1个病毒，从而实现针对不同sgRNA相对应基因的功能筛选。
4.阳性或阴性筛选筛选
工作的另一项重要步骤是选择恰当的筛选策略，比如加药处理。根据研究目的不同，CRISPR高通量筛选分为阳性筛选和阴性筛选。
5.高通量测序与生信分析
利用生物信息学方法寻找候选基因，排除假阳性或假阴性筛选结果。从所选的细胞亚群中提取基因组DNA，DNA模板应足量以保证文库的丰度。在提取基因组DNA后对sgRNA的靶向区域进行PCR扩增，随后对这些区域进行高通量测序以量化它们的相对丰度。根据筛选前后的sgRNA相对丰度变化确定sgRNA是被富集还是消耗，从而确定基因型与表型之间的关系。利用生物信息学工具可通过评估同一基因中多个sgRNA的富集水平来确定某一基因是否在相同背景下显著富集。
6.验证候选基因
用CRISPR/Cas9技术筛选出若干个候选基因后，需要通过一系列方法进行验证，从而鉴定出调控特定表型的功能基因。候选基因的进一步验证非常必要，使用CRISPR/Cas9技术进行单个基因敲除，通过筛选单克隆细胞构建候选基因敲除细胞系，在基因分型和免疫染色确认基因已被敲除后，确定其作用是否由基因敲除所致。

服务内容：

1. Cas9稳转细胞株的构建
2. sgRNA设计合成或者GeCKO v2双质粒系统sgRNA文库扩增

3.单基因突变细胞群落筛选
4.药物处理
5.对照组和加药组基因组提取
6.测序文库构建
7.sgRNA富集分析（MaGeCKFlute工具箱分析）
8.结题报告撰写




艾迪项目案例：
A549 Cas9细胞sgRNA文库稳转细胞库（cell pool）构建服务内容

1. 前期技术咨询（免费）;
2. 细胞株抗生素敏感浓度摸索；
3. A549细胞Cas9稳转细胞株构建；
4. sgRNA设计合成（共2026条，4*504基因+10条对照sgRNA）；
5. sgRNA载体文库构建（覆盖度≥90%）；
6. sgRNA载体文库质控测序；
7. 文库sgRNA补充构建（鉴于第一轮芯片合成仅能够保证≥90%的覆盖度，剩余的sgRNA将进行单个合成，最终保证覆盖率100%）；
8. sgRNA慢病毒文库包装；
9. sgRNA慢病毒文库滴度测定；
10. A549细胞sgRNA文库稳转细胞库筛选（由于存在一定比例的致死基因，因此筛选后sgRNA的代表性和上面文库的覆盖度可能不一致）。

结果材料：

1. sgRNA载体文库序列信息；
2. sgRNA文库载体（5-10 μg）；
3. A549细胞sgRNA文库稳转细胞库(T25培养瓶，细胞不少于3x10⁶；即每个sgRNA的代表性约为1500个细胞；同时我司会保留一份等量备份细胞)；
4. 完整项目结题报告1份(PDF文件)；
5. 其他要求和客户协商交付。