文献支持稳转细胞株构建/稳定株构建/耐药细胞株

一种药物长期作用于某类细胞，杀死其中没有抗性的细胞，而对这类细胞中具有抗性的细胞不能杀死，即进行了选择。具有抗性的细胞大量繁殖产生很多抗性后代，但再用这种药物时表现出的药效大大下降的现象就是细胞的耐药性，采用体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击方法诱导肿瘤细胞对特定药物产生耐药性，从而构建出对特定药物产生耐药性的肿瘤细胞株。

耐药细胞株构建的原理

细胞与低剂量的药物长期接触，引起细胞本身药物化学过程的改变，细胞膜上出现Pgp糖蛋白，使细胞逐渐对药物耐受，随着药物浓度的递增，其耐受程度逐渐加强。

耐药细胞株构建方法

A.  检测亲本细胞株的IC50

IC50(half maximal inhibitory concentration),即半抑制浓度,指某一种物质对某些生物程序抑制达到50%抑制效果时的浓度。对细胞增殖方面,可以理解为对细胞增殖的抑制效果达到细胞正常增殖水平50%时的药物浓度。通常用IC50来衡量药物对细胞的毒性或者细胞对药物的耐受能力,在药物实验中,常用IC50来评估实验中使用的药物浓度。IC50的计算方法很多,常用的有Excel、graphpad prism、SPSS等。

B.  药物浓度递增法/大剂量药物冲击法

1) 大剂量药物冲击法：将处于对数生长期的肿瘤细胞（汇合度60%-80%）置于含有浓度的药物浓度的培养液中培养，弃去培养液，PBS清洗2遍，更换不含药物培养基，常规培养，待细胞恢复生长，培养一段时间后重复上述操作，将筛选出的细胞在一定浓度的药物浓度培养液中继续培养依这样不断改变作用时间，共经过1h、2h、4h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h共10个作用时间段，约6-8个月的培养，最终使得细胞能够在一定浓度的药物的培养液中持续稳定生长并传代，然后脱药培养1个月在检测细胞的生物特性及耐药指标。

大剂量药物冲击法优点是与临床上大剂量化疗药物冲击的治疗方式相接近，但是缺点在于大剂量药物冲击法的药物浓度很高，细胞培养由于外环境骤变，细胞可能难以耐受，细胞状态较难控制，且耐药性能不稳定。

2) 药物浓度递增法：取处于对数生长期的肿瘤细胞（汇合度60%-80%），加入起始浓度为低浓度（建议为亲本细胞株的IC50的1/10-1/5）的药物作用24h，弃去培养液，PBS清洗2遍，更换不含药物培养基，细胞恢复生长后，消化传代复以低浓度作用细胞24h，待细胞增殖至正常形态后，重复上述药物冲击，每种浓度冲击6-8次。待细胞在此浓度稳定生长后，提高药物浓度继续培养，药物依次递增浓度加药。药物诱导历时6-8个月，直到细胞能够在浓度的药物中稳定生长。

药物浓度递增法优点在于诱导耐药细胞的药物剂量循序渐进，细胞培养的外环境逐渐改变，细胞较易耐受，状态较好，缺点在于诱导耐药过程耗时很长，且其化疗药物的作用方式与临床上化疗药物大剂量短疗程的化疗原则存在一定的差异；

C.  检测耐药细胞株的IC50　

检测耐药细胞株的IC50，根据IC50值计算出耐药指数（resistanceindex, RI），RI=耐药细胞系的IC50/亲代细胞系的IC50，RI>5则认为耐药细胞系的耐药性符合耐药株的要求。