空间转录组测序

提供商 ：上海吉凯基因医学科技股份有限公司

服务名称 ：空间转录组测序

一、产品简介
空间转录组是指：通过一次实验可得到样本的mRNA表达信息，并且可以比对到相应的H&E 染色图像，达到图像化和数字化的高度整合分析。空间转录组学分析可展示组织切片中不同区域的基因表达情况，揭示精细病理区域中激活的信号通路， 完成分子特征驱动病理特征的机制解析。空间转录组被广泛用于肿瘤，发育生物学，神经科学等多领域，为肿瘤异质性、肿瘤微环境、复杂疾病的机制解析提供新的见解。


二、技术原理

空间转录组的核心在于独特的捕获芯片，正式文库构建的芯片上有 4 个捕获区域（6.5mm X6.5mm，可以加 4 个样本），每个捕获区域含有约 5000 个被条形码标记的点（barcoded spots），每个 spot 直径 55μm，spot 与 spot 中心点之间的距离为 100μm，每个 spot 含有上百万个可以与 mRNA 结合的捕获探针，每个探针上都带有独特的 spatial barcodes，用以标记捕获的 mRNA 的空间位置。



三、实验流程

10x visium空间转录组测序目前可以支持OCT样本和FFPE样本，两类样本在实验流程上的不同之处在于下图所示的红框部分，OCT样本质检合格以后，将组织切片切到玻片的捕获区域，然后进行固定，用已经摸索好的透化条件进行透化，释放出细胞中的RNA，释放出的RNA直接与玻片上的RNA捕获探针结合后，进行扩增建库测序，获取组织的基因表达信息

针对FFPE样本的特殊性，会多了上图红框部分，10x Visium目前针对小鼠（1.8万个基因）和人（2万个基因）的基因数据库设计了探针，每一个基因（人和小鼠），都预先设计了一对probe以靶定RNA的特定序列，LHS（左端探针）带有read2序列，用以后续PCR扩增，RHS（右端探针）带有polyA序列，用以后续被玻片上的探针捕获结合，通过probe与组织内RNA杂交，将RNA信息转移到probe上，再将探针两端连接形成完整的DNA链。之后降解杂合RNA链，然后透化释放连接的probe，完成信息捕获过程（FFPE样本不需要针对不同类型的样本摸索透化条件，所有的样本类型都用同样的透化条件）。
捕获的probe在玻片上进行延伸反应，生成cDNA，回收单链cDNA并构建测序文库进行上机测序，从而获取基因表达信息。载玻片上的每个捕获区域都有一个oligo阵列，每条oligo上包含与probe结合的捕获探针，该oligo同时具备描述空间信息的标记性序列。

  基于探针设计捕获方式，FFPE样本文库构建大小在240bp左右，不同于冰冻组织450-470bp；测序深度在25k reads pair/per spot左右即可满足分析需要，不同于冰冻组织50k reads pair/per spot的要求



四、产品特色
样本收集灵活：可以用OCT包埋样本或者是石蜡包埋样本，长期储存
分辨率高：每个捕获区域有5000个mRNA捕获点
时效性高：实现远程全息数字切片扫描实时交流
样本兼容范围广：大部分人、大/小鼠组织都可以建库
专业的组织透化方案：OCT样本通过荧光强度和RNA扩散程度确定最佳组织通透时间，FFPE样本不需要进行透化预实验的摸索，透化条件都是统一的
结果可验证性强：当前常用的实验手段，比如免疫荧光等可轻松验证实验结果


五、取样要求
1、新鲜组织直接OCT包埋后干冰速冻，注意表明样本的方向，样本于-80℃保存
2、石蜡包埋的FFPE样本包埋后低温保存（4度或者-20℃）
3、样本处理和运输过程需要在低温环境（干冰或冰袋）
4、如果样本充足，建议准备≥2份样本，一份用于RNA质控和正式切片实验，一份留作备用
吉凯承接过的部分空转样本



五、数据分析





应用案例：


研究目的：利用空间转录组测序解决肝癌异质性问题
样本信息：7名患者的 21 个组织
测序策略：10x Visium，84823个spots
结论：从非肿瘤到肿瘤边缘到肿瘤区域的空间肿瘤微环境 (TME) 特征的顺序比较表明，肿瘤包膜可能影响肿瘤内空间簇的连续性、转录组多样性和免疫细胞浸润



研究目的：利用空间转录组测序+单细胞测序，揭示结直肠癌肝转移的免疫动态变化
样本信息：20 名患者（n = 11，未治疗，50个样本；n = 5，  PD/SD，13个样本；n = 4，PR，26个样本）共 89 个样本进行了单细胞转录组测序，4 名患者（n = 2，未治疗；n = 2, PR)共8个样本进行了空间转录组测序
测序策略：10x Visium+scRNA-seq（共捕获了 178,630个CD45+ 细胞，平均每个样本包含2,007 个细胞，基因中位数为 178,630个基因）
结论：免疫微环境显示出从原发部位到转移部位的动态细胞和空间变化，在 NAC 治疗后，免疫表型在有反应的患者中经历了抗肿瘤重塑，但在无反应的患者中转向更多的免疫抑制





研究目的：利用空间转录组测序+单细胞测序构建小鼠胎儿肝脏(FL)的时空转录组图谱
样本信息：4个胚胎肝脏（scRNA-seq，E11.5 到 E14.5 天的小鼠胚胎肝脏共4个，流式分选HC、EC、NC、HSCs/MPPs四种细胞，按照特定比例混合上样，捕获细胞数32449），1个胚胎肝脏（10x Visium，E14.5 胚胎肝脏，沿背腹轴切4张切片，3791个spots）
测序策略：10x Visium+scRNA-seq
结论：解析了造血干/祖细胞和微环境细胞的转录组动态变化，验证了 HSCs / MPPs 与微环境细胞间的相互作用