Ni-TEDBeads6FF的重力柱

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供应商 ：北京索莱宝科技有限公司

规格 ：1x1mL

Ni-TEDBeads6FF的重力柱
 

 Ni Smart Beads 6FF 的重力柱说明书

货号：YA2400
规格：1*1mL / 1*5mL / 5*1mL / 3*1mL+1*5mL / 5*5mL
保存：2-8℃
产品说明：
    Ni Smart Beads 6FF 是利用 Ni2+与蛋白质侧链上的某些氨基酸(主要为组氨酸、半胱氨酸、色氨 酸)相互作用而进行分离纯化，适用于 His 标签蛋白及与Ni2+具有相互作用的生物分子的分离纯化。强结 合的 Ni2+可以直接用于真核表达系统分泌表达的 His 标签蛋白且耐受更高的还原剂、螯合剂，无需进 行样品前处理；介质的清洗再生工作简单，无需脱镍直接进行 NaOH 清洗。
特点如下：
A.快速、简单（一步纯化）。
B.耐受更高的还原剂、螯合剂，真核分泌表达的 His 标签蛋白无需前处理即可上样，最大限度的保护
蛋白活性。
C.无需脱镍直接进行NaOH 清洗，大大缩短了清洗周期。
D.镍脱落比传统 Ni NTA Sepharose 6FF（IDA）和 Ni Beads 6FF (IMAC）更低，无需反复再生。
表 1：介质性能参数

纯化流程：
1、Buffer 的准备
溶液配制（如果是包涵体纯化，在下述平衡液、洗杂液、洗脱液中添加 8M 尿素或 6M 盐酸胍）
平衡液：0.02M PB、0.5M NaCl，调节 pH 7.4，室温保存。
备注：平衡液中 NaCl 是为了抑制介质的离子交换作用。
洗杂液：0.02M PB、0.5M NaCl、0.005-0.01M 咪唑，调节 pH 7.4，室温保存。
Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd
Tel: 400-968-6088
Fax: 010-56371281
Http://www.solarbio.com
备注：根据最终使用需求：非变性样品纯化时，在洗杂液中加入 0.005-0.01M 咪唑（优先考虑回收率）或者直接在平衡液中加入 0.005-0.01M 咪唑（优先考虑纯度）；变性样品纯化时，平衡液中 建议不可加入 0.005-0.01M 咪唑，否则结合强度、载量均会有一定的下降。
洗脱液：0.02M PB、0.5M NaCl、0.5M 咪唑，调节 pH 7.4，室温保存。
备注：一般情况下，洗脱液中咪唑浓度在 0.02-0.10M 即可洗脱下目标蛋白。
2、样品准备
    上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和 pH 值，可以用结合/洗杂缓冲液对血清样品、腹
水或细胞培养液稀释，或者样品用结合/洗杂缓冲液透析。
    样品在上样前建议离心或用 0.22μm 或 0.45μm 滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止 堵塞柱子。
备注：蛋白的结合能力随着裂解物类型、目标蛋白性质、流速、pH 变化而变化，低流速常常能增
加样本的结合效率。
3、样品纯化
1) 将Ni Smart Beads 6FF 重力柱固定在铁架台上，依次去掉上端塞和下端塞，流干重力柱的 保护液。
2) 向管中加入 5 个柱体积的去离子水，去除残留的保护液。
3) 向柱管中加入 5 个柱体积的平衡液，进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起 到保护蛋白的作用。
4) 将样品加到平衡好的重力柱中，样品保留时间至少 2min，保证目的蛋白与介质充分接触， 提高目的蛋白的回收率。收集流出液，用于 SDS-PAGE 分析蛋白质的结合情况，在出现问题时，更方便寻找解决问题的方案。
5) 用 10-15 倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
6) 使用 5-10 倍柱体积的洗脱液进行目的蛋白的洗脱，分段收集，每一个柱体积收集一管， 分别检测，既可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱，又可以得到高纯度和高浓度的蛋白。
7) 依次使用 3 倍柱体积的平衡液和 5 倍柱体积的去离子水平衡填料。将重力柱保存在等体积的
20%乙醇中，置于 2-8°C 保存 ，防止填料被细菌污染。
4、SDS-PAGE 检测
    将使用纯化产品得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用 SDS-PAGE 检测纯化效果。
填料清洗
    清洗后可以去除一些强结合性物质（例如一些强结合的蛋白、变性蛋白、脂类等），从而达到 恢复介质的优良性能（例如载量、流动性、柱效等）。
    建议每使用 5-10 次后进行一次清洗，具体清洗频率需根据纯化的初始样品的洁净度进行调整。
A、用 5-10 倍柱体积纯化水冲洗。
备注：用于去除洗脱液（使用后直接清洗）或 20%乙醇（使用前清洗）。
B、用 5-10 倍柱体积 1M NaOH 后静置 0.5-1 小时，再用 10-20 倍柱体积纯化水冲洗直至 pH 至 中性。
备注：用于去除聚集在介质中的沉淀蛋白或疏水性结合蛋白或脂蛋白等。
C、用 5-10 倍柱体积的 20%乙醇冲洗后保存。
备注：20%乙醇可以防止微生物的生长，20%乙醇保存的介质储存在 2-8℃。