PicoGreendsDNA定量检测试剂盒

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供应商 ：北京索莱宝科技有限公司

规格 ：1ml

PicoGreendsDNA定量检测试剂盒


PicoGreen dsDNA定量检测试剂盒说明书
货号：P9740
规格：2000T
保存：4℃避光保存，有效期1年。
产品内容：

名称	规格	保存
PicoGreen component-A(200×in DMSO)	1mL	4℃避光保存
PicoGreen component-B(TE buffer)	200mL	4℃避光保存
PicoGreen component-C(Calf ThymusDNA)	1mL	4℃避光保存

产品说明：
  在分子生物学的试验过程中，PicoGreen dsDNA 定量试剂盒是荧光检测双链DNA并进行定量的一种产 品，这种方法非常灵敏。常用于分子生物学技术中的：cDNA文库的构建；用于亚克隆的DNA片段纯化及应用，比如进行 DNA 定量、产物扩增和引物的进一步检测。疫苗是现代疾病预防中常用的控制方式。如今许多疫苗是细胞培养疫苗，比如重组乙肝疫苗、狂犬病疫苗等大多数疫苗都采用细胞培养的方法生产。其中，疫苗的纯化是关键问题，我们需要尽可能的去除宿主细胞DNA和宿主蛋白。假若宿主细胞的DNA和蛋白同疫苗一起注入人体将会产生不可预料的后果。

常规的DNA含量的检测方法是在260nm（A260）处测其吸光值。这种方法的主要缺点是核苷酸、单链核酸和蛋白质对信号的影响很大，并且还会受到核酸制备过程中污染物的干扰，无法区分DNA和RNA，而且这种方法不灵敏（5µg/mLdsDNA 溶液A260=0.1）。PicoGreen定量检测方法简单、方便，被多家生物制品厂所选择，成为生物制品残留DNA检测的标准。

   PicoGreen与DNA双链结合后才发出的荧光，无DNA不发荧光；所发荧光与DNA浓度成正比。在2010年《中国药典》中提出，PicoGreen定量DNA的方法检出限约0.3ng/mL，DNA含量在1.25-80ng/mL范围时线性较好(R²>0.99).
优点：

1. 该方法可以测定来源于任何表达宿主样品中的双链DNA。
2. 可以直接定量PCR扩增产物而无需从反应混合物中纯化DNA。
3. 远远超出传统紫外A260的检测方法和Hoechst33258的灵敏度。
4. 较高浓度的盐，尿素，乙醇，氯仿，去垢剂，蛋白或琼脂糖对测定无影响。
5. 在等摩尔浓度 ssDNA和RNA存在的条件下测定dsDNA，其影响很小。

所需器材：
微型荧光计；微量检测皿适配器；1cm石英比色皿
试剂制备：
PicoGreen dsDNA定量试剂是以1mL 的浓缩液形式保存在无水的DMSO（二甲基亚砜）中。实验当天，配制1X PicoGreen试剂的工作溶液，用TE buffer（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.5）按1:200的比例稀释PicoGreen component-A浓缩液。由于试剂容易吸附到玻璃表面，要在塑料容器中配制。PicoGreen试剂见光易降解，所以应将配好的溶液用箔包住或放置暗处避光保存。溶液最好在配制好数小时内使用，以保证最佳结果。注意：TE buffer是1×TE buffer。
实验方法：
1)、标准品工作液的配制：
Sigma小牛胸腺嘧啶DNA干粉1mg（Tris，Nacl等浓度已成标准体系），加入1 mL双蒸水，配制成1 mg⁄mL的标准品工作液；
2）、染料工作液的配置：
5 μL PicoGreen加入1 mL TE buffer(注意：用TE buffer将PicoGreen稀释200倍，现用现配，注意避光)。
3）、标准品工作液稀释：
1、母液稀释：取10 μL（1 mg⁄mL）标准品工作液加入到990 μL TE buffer溶液中，浓度稀释成10 μg⁄mL，取10 μL（10 μg⁄mL）标准品工作液加入到990 μL TE buffer溶液中，浓度稀释成100 ng⁄mL；
2、倍比稀释：取800 μL（100 ng⁄mL）的标准品工作液加入到200 μL TE buffer溶液中，浓度达到80 ng⁄mL（药典规定：荧光染色方法DNA含量在1.25-80 ng/mL范围线性较好，该法DNA检出限为0.3 ng/mL），取500 μL（80 ng⁄mL）的标准品工作液加入到500 μL TE buffer溶液中，浓度稀释到40 ng⁄mL；依次倍比稀释，配成20 ng/mL、10 ng/mL、5.0 ng/mL、2.5 ng/mL、1.25 ng/mL、0.625 ng/mL的标准品溶液；
4）、标准曲线的制备：倍比稀释后的各梯度标准品溶液和染料工作液各取100uL混匀，避光室温放置5min。使用荧光仪检测样品的荧光值：将混合后的溶液加入微量比色皿，确信不要在样品中引入气泡，轻轻地弹微量检测皿的外部，可以驱散气泡。以TE buffer缓冲液为blank，激发波长 488nm，发射波长 520nm，测定样品和空白对照的荧光值；用标准品溶液的浓度（ng/mL）对应的荧光强度作直线回归，制备标准曲线。

待测DNA最终浓度(ng/mL)	100	50	40	20	10	5	4	2	0.5	0
荧光读值	6210	3195	2507	1261	620.8	298	258.8	152	43.8	0.72

5）、测量样品的荧光值。荧光计将给出一个直接的浓度读数，数据可以用来产生DNA 浓度的标准曲线。