普氏立克次体(RP)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)

普氏立克次体(RP)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)

价格: ¥2750

品牌:YLKBIO

货号:YLK-PCR0341

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库存 :100

英文名 :Rickettsia prowazeki Detection Kit (Real-Time PCR Method)

CAS号 :

保质期 :1年

供应商 :优利科(上海)生命科学有限公司

保存条件 :-20℃

规格 :50T

普氏立克次体(RP)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)
 
通用名称:普氏立克次体(RP)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)
Name :Rickettsia prowazeki Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】25T/盒、50T/盒

【预期用途】

斑疹伤寒是由普氏立克次体(R .prowazekii)或莫氏立克次体(R.mooseri)引起的急性感染性疾病,普氏立克次体引起的感染称为流行性斑疹伤寒,而莫氏立克次体引起的称为地方性斑疹伤寒[1]。流行性斑疹伤寒为虱传播,临床症状较重,主要表现为高热、头痛、皮疹,甚至神经性症状显著,可出现听觉障碍、神志迷糊直至死亡。目前, 普氏立克次体的临床诊断主要依靠血清学检测,但是由于特异性抗体出现较晚,故无法在早期对该病进行诊断。培养分离方法操作复杂和耗时,而且成功率不高。普通 PCR 法显得不敏感,加上 PCR 法的其它缺陷,使得普氏立克次体的PCR 检测难以在临床上推广使用。实时荧光定量 PCR 是一种快速检测病原体的高特异和高敏感技术[2]。
本试剂盒利用实时荧光定量 PCR 原理,定性检测普氏立克次体,对普氏立克次体的诊断及疗效评估有重要指导意义。

【检验原理】

本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术,针对普氏立克次体基因高度保守区设计一对特异性引物和探针,利用相应仪器对 PCR 过程进行实时监测,实现检测结果的定性分析,用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

包装规格 25T/盒 50T/盒
RP 反应液 500μL×1 管 500μL×2 管
酶液 25μL×1 管 50μL×1 管
RP 阳性质控品 50μL ×1 管 50μL ×1 管
阴性质控品 250μL ×1 管 250μL ×1 管
说明:不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次,有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量PCR 检测仪。

【标本采集】

适用于人体的血液、体液和棉拭子等多种样本。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过 6 个月,标本运送应采用 2~8℃冰袋运输, 严禁反复冻融。

【使用方法】

  1. 样品处理(样本处理区)
    1. 样本前处理
血液、体液和棉拭子样本取 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中
    1. 核酸提取
推荐采用优利科(上海)生命科学有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(磁珠法或离心柱法)进行核酸提取,请按照试剂说明书进行操作。
  1. 试剂配制(试剂准备区)
根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;反应管数每满 10 份,多配制 1 份),每测试反应体系配制如下表:
试剂 RP 反应液 酶液
用量(样本数为N) 20μL 1μL
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中,21μL/管。
  1. 加样(样本处理区)
将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,短暂离心。
  1. PCR 扩增(核酸扩增区)
    1. 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内;
    2. 设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25μL;
荧光通道选择: 检测通道(Reporter Dye)FAM, 淬灭通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列仪器请勿选择
ROX 参比荧光,选择None 即可。
    1. 推荐循环参数设置:
步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号
1 1 cycle 95℃ 10min
2 40 cycles 94℃ 15sec
55℃ 30sec



  1. 结果分析判定
    1. 结果分析条件设定
设置Baseline 和Threshold:一般直接按机器自动分析的结果分析,当曲线出现整体倾斜时,根据分析后图像调节Baseline 的start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节),以及 Threshold的Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照),重新分析结果。
    1. 结果判断
阳性:检测通道 Ct 值≤35,且曲线有明显的指数增长曲线;
可疑:检测通道 35<Ct 值≤38,建议重复检测,如果检测通道仍为 35<Ct 值≤38,且曲线有明显的增长曲线, 判定为阳性,否则为阴性;
阴性:样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。
  1. 质控标准
阴性质控品:Ct>38 或无 Ct 值显示;
阳性质控品:扩增曲线有明显指数生长期,且 Ct 值≤32; 以上条件应同时满足,否则实验视为无效。
  1. 检测方法的局限性
  1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;
  2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;
  3. 阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;
  4. 病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;
  5. 不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;
  6. 试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果;
  7. 本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

  1. 所有操作严格按照说明书进行;
  2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化,完全混匀并短暂离心;
  3. 反应液应避光保存;
  4. 反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;
  5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;
  6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;
  7. 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;
  8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】

  1. 俞树荣,陈香蕊。立克次体与立克次体病。第一版。北京:军事医学科学出版社,1999.24-31
  2. Pusterla N , Huder JB, Leutenegger CM , et al. Quantitative real- time PCR for detection of members of the Ehrlichia phago-cytophila genogroup in host animals and ixodes ricinus ticks〔J〕. J Clin Microbiol , 1999, 37: 1329- 1331.



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