Vibrio Cholera (Gene CTX) Real Time PCR Kit

【试剂盒主要组成成份】

说明：不同批号的组分不可以互换使用。



【储存条件和有效期】试剂盒应在－20℃及以下温度避光保存，有效期 12 个月。采用冰壶加冰或泡沫盒加冰密封进行运输；荧光 PCR 检测混合液反复冻融不宜超过 3 次。
【适用仪器】本试剂盒适用于PE5700,MJ-Opticon 等单色荧光PCR 仪；
ABI7000, ABI7300, ABI7500, ABI7900, MJ-chromo4, Mx3000P,
MX3005P, SmartCyclⅡ, Rotor-Gene6000,Lightcycler480, iCycleriQ4， iCycleriQ5，Bio-Rad CFX96，SLAN 等多色荧光 PCR 仪及相应软件。
【标本要求】粪便或水样标本可立即用于测试。

【检验方法】

1. 粪便标本： 挑取米粒大小粪便（尽可能取黏液脓血部分），于放置有 0.5ml 生理盐水的离心管中， 振荡混匀，13,000rpm 离心 2 分钟。去尽上清，沉淀中直接加入 100ml DNA 提取液充分混匀，沸水浴10 分钟（误差不超过 1 分钟）。13,000rpm 离心 5 分钟，取上清 4ml 做 PCR 反应。
2. 水标本：取水样 3ml，13,000rpm 离心 2 分钟；弃去上清，沉淀中直接加入 100ml DNA 提取液充分混匀，沸水浴 10 分钟（误差不超过 1 分钟）。13,000rpm 离心 5 分钟，取上清 4ml 做 PCR 反应。
3. 食物标本：选取可疑食物 1 g，于放置有 1 ml 生理盐水的离心管中， 颠倒混匀三次，静置 2min，将上清转移至另一离心管中， 13,000rpm 离心 2 分钟。去尽上清，沉淀中直接加入 100ml DNA 提取液充分混匀，沸水浴 10 分钟（误差不超过 1 分钟）。13,000rpm 离心 5分钟，取上清备用。食物标本如在肉汤培养基中增菌 6h     后取菌液检测可提高检测灵敏度：取增菌液 1ml，13,000rpm 离心 2 分钟，弃上清，沉淀中直接加入 100ml DNA 提取液充分混匀，沸水浴 10 分钟（误差不超过 1 分钟），13,000rpm 离心 5 分钟，取上清备用。
   H2O 为阴性对照。如果进行定量检测，阳性对照品需要进行 10、100、1000 倍梯度稀释。

   试剂配制

    

   1. 反应管中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧。
   2. 不同批号的试剂请勿混用，请在有效期内使用试剂盒。
   3. Chien-Hsien Chen, Toshio Shimada, Nasreldin Elhadi, Son Radu, and Mitsuaki
   取 n×35ml  CTXAB 核酸荧光检测混合液与 n×1ml 内部对照品，以及n×0.4ml 酶（Taq+UNG） (n 为反应管数)，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒。

   备注：如不使用内部对照品，可用 n×1ml 的 H2O 代替补足。

1. 加样取上述混合液 36ml 置于薄壁 PCR 反应管或PCR 反应板中，然后将已处理标本、阳性对照品、H2O 各 4ml 分别加入薄壁 PCR  反应管 或 PCR 反应板中，盖好薄壁 PCR 反应管盖或 PCR 反应板膜，立即进行
   PCR 扩增反应。
2. PCR 扩增 反应管置于定量荧光 PCR 仪上，推荐循环参数设置：37℃×2min; 94℃×2min;再按 93℃×15sec→60℃×60sec，循环 40
   次;单点荧光检测在 60℃.反应体系为 40ml。
   荧光通道检测选择：检测选用 FAM 和 HEX(或 VIC/JOE)通道。备注：如使用 ABI 系列 PCR 仪，请务必于 passive reference 和
   quencher 处均选择“none”。
3. 基线和阈值设定 基线调整取 6-15 个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过H2O 检测荧光曲线的最高点。
4. 校准程序 阳性对照品处理和加样在检验方法的 1 和 3 中已经说明； 实验结束后将阳性对照品及其稀释品浓度输入仪器软件中，仪器自动生成标准曲线。
5. 质量控制 试剂盒各对照品须达到以下要求，否则实验视为无效。

6. 	FAM 通道 Ct 值 （目的基因）	HEX 或 VIC/JOE 通道 Ct 值 （内部对照品）
   H2O	UNDET 或 40	25~35
   阳性对照品	≤35	——
   标准曲线（如有）	相关系数应≤－0.98

7. 试验结果的判断

8. 	通道	Ct 值	结果判断
   1	FAM	UNDET 或 40	样本低于检测限，报告为阴性
   2	FAM	≤35	报告为阳性
   3	FAM	35～40	复检一次,如仍为 35～40,则报告为阴性

   进行定量检测时，仪器生成标准曲线后，自动显示待检样品定量值。
   【参考值范围】阴性（检测对象Vibrio cholerae为病原微生物，在健康人体中不存在）。
   【对检验结果的解释】实验室环境污染，试剂污染，样品交叉污染会出现假阳性结果；试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果。内部对照品在HEX(或 VIC/JOE)通道显示 UNDET 表明 PCR 反应受到抑制。
   【检验方法的局限性】当检测样本中被检核酸浓度含量低于最低检测限 1×103copies/ml 时可能会发生假阴性的结果。
   【产品性能指标】最低检测限：1×103copies/ml；
   线性检测范围：1×104～1×108copies/ml。
   【注意事项】开始检测前请仔细阅读本说明书全文。
9. 整个检测过程应严格分在三区进行：PCR 反应体系的配制区；标本处理、加样区；PCR 扩增、荧光检测及结果分析区。各区使用的仪器、设备、耗材和工作服应独立专用。实验后即请清洁工作台，并进行消毒。
10. 使用不含荧光物质的一次性手套(经常替换) 、一次性专用离心管、自卸式移液器和带滤嘴吸头。
11. 试剂准备和标本处理应使用超净工作台(负压式)或防污染罩，以防止对环境污染。
12. 每次实验应设置阴、阳性对照品。
13. 操作人员应经过专业培训，具有一定经验和操作技能。
14. 操作台、移液器、离心机、PCR 扩增仪等仪器设备应经常用 10%次氯酸或 75%
15. 酒精、紫外线灯或臭氧消毒处理。实验中接触过标准品和对照品的废弃物品（如吸头）、扩增完毕的离心管、标本等应进行无害化处理后方可丢弃。
    试剂使用前应在常温下充分融化并混匀。
    9. PCR 反应混合液应避光保存。
16. 反应管中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧。
17. 不同批号的试剂请勿混用，请在有效期内使用试剂盒。