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文献和实验
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库存 :100
英文名 :Mumps Virus(MV) SYBR qRT-PCR Kit
CAS号 :无
保质期 :1年
供应商 :优利科(上海)生命科学有限公司
保存条件 :-20℃
规格 :50T
腮腺炎病毒染料法荧光定量 RT-PCR 试剂盒产品及特点腮腺炎病毒(Mumps Virus,MV)是一种 RNA 病毒,人是腮腺炎病毒惟一宿主,病毒经飞沫传播,易感者为学龄期儿童,好发于冬春季节。本病潜伏期约 2~ 3 周,病毒侵入呼吸道上皮细胞和局部淋巴结内增殖后,进入血流,然后经血流侵入腮腺及其它腺体器官如睾丸、卵巢、胰腺、肾脏和中枢神经系统等。临床表现主要为一侧或双侧腮腺肿大,伴发热、乏力、肌肉疼痛等,并发睾丸炎者可导致男性不育症,腮腺炎也是导致儿童期获得性耳聋的常见原因,因此腮腺炎病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。本产品基于 PCR 原理开发。它具有下列特点:
- 一站式,用于不需要单独准备每种成分,包括引物和对照。
- 根据腮腺炎病毒的保守基因序列设计的引物,具有良好的特异性。
- 基于染料法 qRT-PCR 检测,灵敏度比常规 RT-PCR 高 10-100 倍,可以达到至少 1000 拷贝/反应。
- 使用一管式 qRT-PCR 技术,RT 和 PCR 两步在一个试管内完成,不需要中间转移样品,降低了操作误差和可能的污染。
规格及成分
成 份 | 十孔盒包装 |
2×qRT-PCR 缓冲液 | 500 μL(棕色管) |
10×qRT-PCR 酶混合液 | 100 μL(红盖) |
ROX 染料I | 50 μL(棕色管) |
ROX 染料 II | 50 μL(棕色管) |
荧光 PCR 专用模板稀释液 | 1mL(亮黄盖) |
腮腺炎病毒 RT-PCR 引物混合液 | 100 μL(白盖) |
腮腺炎病毒 RT-PCR 阳性对照 (1×10E8 拷贝/μL) |
50 μL(黄盖) |
核酸释放剂试用装 | 20 次(1mL,绿盖) |
使用手册 | 1 份 |
运输及保存
低温运输,-20℃保存,保存期限为 12 个月。阳性对照需要因易污染其他成分需
要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供 RNA 片段作为阳性对照。
自备试剂
样品 RNA
使用方法
稀释阳性对照(以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加产品稳定性和避免扩
散传染性病原。
- 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液,最好用带芯枪头,下同)。
- 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供),充分震荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
- 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
- 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品 RNA 的制备
- 如果有 N 个样品,必须设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第 4 号(浓度为 1×10E4 拷贝/μL,10μL 相当于 1 万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样,样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。
- 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送 20 次免 RNA 提取的核酸释放剂试用装。
- 如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照,6 个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),1 个用于 PCR 阳性对照(用第 4 号阳性对照稀释液做模板)。下面只描述定量分析的步骤,定性分析只是把 6 个标曲反应缩减成 1 个,其余不变。
- 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设
成分 | N+2 个制备 所得样品 |
RT-PCR 阴性对照 |
RT-PCR 阳性 对照(2-7 管) |
2×qRT-PCR 缓冲液 | 10μL | 10μL | 各 10μL |
口蹄疫病毒 RT-PCR 引物混合物 |
2μL | 2μL | 各 2μL |
50×ROX (见注) | 0.4μL | 0.4μL | 各 0.4μL |
样品制备所得 RNA 模 板(来于第 8 步) |
5.6μL | 不加 | 不加 |
稀释所得 6 个阳性对照 (来于第 6 步) |
不加 |
不加 |
各 5.6μL(2 号样到 2 号管,3 号样 到 3 号管…) |
10×qRT-PCR 酶混合液 |
2μL | 2μL | 2μL |
注:需使用 ROX 染料 I 的机型:ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、 Step-One、Step-One Plus。
需使用 ROX 染料 II 的机型::ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research
的 Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用 ROX 的机型:Thermal Cycle Dice Real Time System, LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。
- 上机后按下面参数进行 RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)。注:需使用 ROX 染料 I 的机型:ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、 Step-One、Step-One Plus。
需使用 ROX 染料 II 的机型::ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research
的 Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用 ROX 的机型:Thermal Cycle Dice Real Time System, LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。上机后按下面参数进行 RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)。注:需使用 ROX 染料 I 的机型:ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、 Step-One、Step-One Plus。
需使用 ROX 染料 II 的机型::ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research
的 Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用 ROX 的机型:Thermal Cycle Dice Real Time System, LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。 - 上机后按下面参数进行 RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)。
过程 | 温度 | 时间 |
RT(逆转录) | 50℃ | 15-30 分钟 |
预变性 | 94℃ | 2 分钟 |
RT - PCR 反应 (30 个循环) |
95℃ | 15 秒 |
60℃ | 15 秒(采集 FAM 通道的荧光信号) | |
72℃ | 15 秒 | |
按仪器预设程序进行溶解曲线分析 |
数据处理
- 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值,再推算出其浓度。
- 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大
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