【产品名称】

通用名称：猪附红细胞体(SEP)核酸检测试剂盒(荧光-PCR 法)
Name ：Swine Eperythrozoon Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】48T/盒

【预期用途】

猪附红细胞体可引起猪出现发烧、皮肤及内脏器官出血、贫血、呼吸道症状及母猪繁殖障碍等症状，造成猪群生产性能下降，免疫力低下、死亡率增加[1,2]。猪附红细胞体可以引起猪群长期的持续性感染和潜伏感染，且易与其他病原混合感染，当与其他病原混合感染后可极大地增加患猪的死亡率，同时也增加了临床上对该病的诊断难度。
本试剂盒适用于检测全血等样本中的猪附红细胞体，用于猪附红细胞体感染的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术，设计猪附红细胞体特异性引物和探针，用荧光 PCR 技术对猪附红细胞体的核酸进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

名称	规格
核酸提取液	1.5mL×2 管
酶液	50μL×1 管
SEP 反应液	1.0mL×1 管
SEP 阳性质控品	50μL ×1 管
阴性质控品	250μL ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融少于 5 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

用注射器取血 5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

样品处理（样本处理区）
1. 样本前处理

取抗凝血下层血细胞 50μL，加入 100μL 双蒸水吹匀

1. DNA 提取
  1. 对上述处理好的标本加入 50μL 核酸提取液，100℃恒温处理 10min，13,000 rpm 离心 5min，取上清液转移至新的 1.5mL EP 管，-20℃保存；
  2. DNA 的提取也可以采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的 DNA 提取试剂盒

（离心柱提取法），请严格按照试剂盒说明书进行操作。

试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂	SEP 反应液	酶液
用量（样本数为 N）	20μL	1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21uL/管。

加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

PCR 扩增（核酸扩增区）
1. 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
2. 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；

荧光通道选择：检测通道（Reporter Dye）FAM，淬灭通道（Quencher Dye）NONE，请勿选择 ROX 参比荧光。

1. 推荐循环参数设置：

步骤	循环数	温度	时间	收集荧光信号
1	1 cycle	95℃	10min	否
2	40 cycles	94℃	15sec	否
2	40 cycles	55℃	30sec	是

结果分析判定
1. 结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。