支原体通用染料法荧光定量PCR 试剂盒

库存 ：100

英文名 ：Mycoplasma spp. SYBR qPCR Kit

CAS号 ：无

保质期 ：1年

供应商 ：优利科（上海）生命科学有限公司

保存条件 ：-20℃

规格 ：50T

产品及特点：
支原体（Mycoplasma）和亲缘关系很近的无胆甾原体（Acholeplasma）、螺旋体
（Spiroplasma）统称霉形体（mollicutes）。霉形体是目前发现的最小的、最简单的原核生物。它们缺乏细胞壁、有变形能力、能通过滤菌器、可在无生命培养基中生长繁殖，成为细胞培养中常见的一种污染源，严重影响细胞生长率、细胞形态、基因表达、细胞代谢和细胞活力。因此，对以支原体为主的霉形体进行早期检测非常重要，它能使得研究人员在污染扩散前快速采取有效措施，减低损失。本产品就是以荧光定量 PCR 技术为基础开发的支原体通用的试剂盒，具有下列特点：

1. 免 DNA 制备，直接用裂解液做 PCR，更加简单快捷。
2. 覆盖广，根据支原体通用高度保守区设计引物，能检测 40 余种霉形体（包括欧盟药典要求检测的 9 种支原体）。
3. 特异性高，跟梭状芽孢杆菌、链球菌和乳酸杆菌等亲缘关系相近的微生物无交叉反应。
4. 灵敏高，可检测低至几个拷贝/反应的支原体污染。
5. 提供无感染性的支原体阳性对照，能有效避免实验结果的假阳性和假阴性。
6. 可用于培养细胞、疫苗、血清、重组蛋白和耗材的污染检测。但不能用于临床诊断。
7. 本产品足够至少 50 次 20 μL 体系的荧光 PCR 检测。

规格及成分：

成  份	包装
2×qPCR MagicMix	0.5 mL（棕色）
荧光 PCR 专用模板稀释液	1 mL（黄盖）
支原体通用染料法 qPCR 引物混合液	100 μL（白盖）
支原体通用染料法 qPCR 阳性对照 (1×10E8 拷贝/μL)	50 μL（黄盖）
核酸释放剂	1mL（绿盖）
使用手册	1 份

运输及保存：低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

自备试剂：样品 DNA。

使用方法：
一、制备标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能
污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1.  标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2.  用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，
下同）。

1.   在7 号管中加入 5 μL 阳性对照（其浓度为 1×10E8 拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
2.   换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
3.   换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4.   重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备
7.  用自选方法纯化样品的 DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。
8.  如果有 N 个样品，则需要进行 N+2 个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。本试剂盒免费赠送 1ml免DNA 提取的核酸释放剂，该释放剂的裂解液可以直接作为PCR 模板，省略了 DNA 提取步骤。其使用手册可向本公司客服索取。

三、设置 qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
9.  如果进行定量分析，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线样品。如果做定性分析，则 6 个标准曲线样品只选一个做（可以选 4 号，其余样品不变）。以下只介绍定量分析的反应设置。
10.  在标记管中按下表加入各成分：

成  份	N+2个样品管	PCR阴性对照管	标准曲线 样品管（2-7 管）
2×qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各 10 μL
支原体通用染料法 qPCR 引物混 合液	2 μL	2 μL	各 2 μL
自备 10×ROX (见注)	2 μL	2 μL	各 2 μL
N+2 个待测样品 DNA 模板	6 μL	不加	不加
自备超纯水	不加	6 μL	不加
第 7 步所得标准曲线样品稀释液（2-7 号）	不加	不加	各 6μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3号管…）

注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、 RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480） 不需要使用ROX，则用水替代。

11.盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化）。

四.荧光定量 PCR 反应参数：

过程	温度	时间
预热	50℃	2 min
预变性	95℃	10 min
PCR 反应 （40 个循环）	95℃	15 sec
	60℃	1 min（采集 SYBR 通道的荧 光信号）
按仪器预设程序进行溶解曲线分析

四 数据处理
12.  设定 60℃-96℃范围的融解曲线分析，排除假阳性。

13.  如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

14.  如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。