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库存 :100
英文名 :Method of the real-time RT-PCR for the detection of Equine Influenza Virus (50 reactions)
CAS号 :无
保质期 :1年
供应商 :优利科(上海)生命科学有限公司
保存条件 :-20℃
规格 :50T
1、 试剂盒简介
马流感是马、驴和骡的一种急性呼吸道疫病,由正黏病毒科 A 型流感病毒属中的两个 A 型流感病毒亚型引起,分别为H7N7(曾称为马-1 型)和 H3N8(曾称为马-2 型)。禽流感病毒被认为是两种亚型马流感病毒的祖先,易感马科动物的临诊症状表现为发热、刺耳地干咳和鼻流黏性脓性分泌物。本试剂盒是依据OIE3.5.7 章马流感诊断国际标准中马流感国际参考实验室推荐的针对M 基因可以同时监测H7N7 和H3N8 等马流感病毒亚型的引物和探针序列,优化反应参数配套生产,探针的 5` 端和 3`端分别标记不同的荧光素,如 5`端标记 FAM 荧光素,3`端是 TAMRA 修饰。
2、 试剂盒组成
核酸扩增试剂具体组成参见表 1:
表 1:试剂盒组成(50test/盒)
试剂盒组成成分 | 体积 |
核酸扩增试剂: DEPC 水 马流感荧光 RT-PCR 反应液酶混合物 阴性对照 马流感荧光阳性对照 |
1ml×1 管 750µL×1 管 55µL×1 管 1ml×1 管 1ml×1 管 |
3、 样本采集,存放及运输
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- 样本采集:所用取样器材必须经高压灭菌并烘干。
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- 存放:样品应尽快研磨提取核酸进行检测,-70 ℃以下可长期保存,但应避免反复冻融。
- 运输:采用冰壶或泡沫箱加冰密封进行运输。
4、 荧光 RT-PCR 检测
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- 操作方法
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- 样本的处理(在样本制备区进行):
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- 取 n 个灭菌的 1.5 mL Eppendorf 管,其中 n 为被检样品、阳性对照与阴性对照的和(阳性对照、阴性对照在试剂盒中已标出),做标记。(注:试剂盒中的阳性对照吹打混匀后直接作为PCR 检测的模板,无需提取核酸)
- 每管加入 600 mL 裂解液,分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各 200 mL,一份样本换用一个吸头,再加入 200 mL 氯仿,混匀器上振荡混匀 5 s(不能过于强烈,以免产生乳化层, 也可以用手颠倒混匀),于 4℃ 12 000 r/min 离心 15 min。
- 取与 4.1.1.1 相同数量灭菌的 1.5 mL Eppendorf 管,加入 500 mL 异丙醇(-20℃预冷), 做标记。吸取 4.1.1.2 各管中的上清液转移至相应的管中,上清液应至少吸取 500mL,不能吸出中间层,颠倒混匀。
- 于 4 ℃、12 000 r/min 离心 15 min(Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置),小心倒去上清,倒置于吸水纸上,沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干);加入 600 mL 75% 乙醇,颠倒洗涤。
- 于 4 ℃、12 000 r/min 离心 10 min(Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置),小心倒去上清,倒置于吸水纸上,尽量沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)。
- 4 000 r/min 离心 10s(Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置),将管壁上的残余液体甩到管底部,小心倒去上清,用微量加样器将其吸干,一份样本换用一个吸头,吸头不要碰到有沉淀一面,室温干燥 3 min,不能过于干燥,以免 RNA 不溶。
- 加入 33 mL DEPC 水,轻轻混匀,溶解管壁上的 RNA,2 000 r/min 离心 5 s,冰上保存备用。提取的 RNA 须在 2 h 内进行 PCR 扩增;若需长期保存须放置-70 ℃冰箱内。
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- 检测
- 扩增试剂准备(在反应混合物配制区进行):
- 检测
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表 2 每个样品测试反应体系配制表
试剂 | RT-PCR 反应液 | 酶混合物 |
用量 | 15 μL | 1.0 μL |
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- 加样(样本处理区进行):
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- 荧光 RT-PCR 检测(在检测区进行):
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第一阶段,反转录 42℃/30 min; 第二阶段,预变性 94℃/2 min;
第三阶段,94℃ /15sec,55℃/10 sec, 60℃/30 sec 共 40 个循环.。荧光收集在第三阶段每
次循环的 60℃延伸时进行。
试验检测结束后,根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。
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- 结果判定
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- 结果分析条件的设定 阈值设定原则:根据仪器噪声情况进行调整,以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点为准。对于多通道荧光 PCR 仪,选定 FAM(465-510)检测通道读取检测结果, ABI 仪器选择 5’FAM; 3’TAMRA 淬灭基团。
- 质控标准
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- 阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。
- 阳性对照的 Ct 值应小于等于 30,并出现典型的扩增曲线。
- 如阴性和阳性对照不满足以上条件,此次实验视为无效。
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- 结果判定
- 阴性:无 Ct 值,且无特征性扩增曲线,表明样品为阴性。
- 阳性:Ct 值≤40.0,且出现典型的扩增曲线,表示样品为阳性,含有马流感病毒核酸。
- 结果判定
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- 实验室应至少分三个区:样品处理区、反应混合物配制区和检测区。
- 各区物品均为专用,不得交叉使用,避免污染。检测结束后,应立即对工作台进行清洁。
- 分装反应液时,应尽量避免产生气泡。上机前注意检查各反应管是否盖紧,以免荧光物质泄露污染仪器。
- 阳性对照在吸取前应在微量漩涡振荡器上剧烈振荡 1~2 秒。
- 试剂盒中各组分应避免反复冻融。
【贮藏与有效期】荧光 RT-PCR 检测试剂盒-20℃保存,有效期为 12 个月;《病毒基因组 DNA/RNA 离心柱型提取试剂盒》室温保存。
5、 相关技术信息(OIE 推荐的引物和探针序列) Forward: 5’-AGA-TGA-GYC-TTC-TAA-CCG-AGG-TCG-3’ Reverse: 5’-TGC-AAA-NAC-ATC-YTC-AAG-TCT-CTG-3’
Probe: 6-FAM-5’-TCA-GGC-CCC-CTC-AAA-GCC-GA-3’-TAMRA
N=A, G, C or T and Y=C or T
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